本試劑盒采用高品質(zhì)原料，經(jīng)大量樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化配方。穩(wěn)定性高，檢測(cè)方便，可檢測(cè)pg級(jí)的抗原。

北京百奧萊博科技有限公司是一家專業(yè)的生物試劑銷售公司。公司主要經(jīng)營(yíng)血清、抗原、抗體等生物試劑產(chǎn)品，可以為您提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，以優(yōu)良的價(jià)格、優(yōu)質(zhì)的服務(wù)、優(yōu)先的理念，滿足客戶的各方面的需求，與國(guó)內(nèi)多家企業(yè)、單位建立了良好的長(zhǎng)期合作關(guān)系，擁有較好的企業(yè)信譽(yù)和品牌形象。 主營(yíng)產(chǎn)品:血清、抗體、抗原、核酸提取、核酸純化等生化試劑

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 高靈敏度

● 低背景

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 雙蒸水

注意事項(xiàng)：

● ECL工作液配制過程中吸取試劑A和試劑B時(shí)務(wù)必跟換吸頭，工作液新鮮配制后立即使用，放置過久會(huì)影響靈敏度。

● 根據(jù)蛋白豐度不同曝光時(shí)間可能是數(shù)秒至數(shù)小時(shí)。

● 曝光時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使背景加深，曝光不足會(huì)導(dǎo)致條帶模糊。

● 如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

● 必須使用高質(zhì)量保鮮膜。

使用方法：

1、使用合適的方法進(jìn)行Western，直至用PBST洗滌二抗。

2、配制新鮮ECL工作液：試劑A和試劑B按1:1混合均勻后即為ECL工作液。須立即使用！

3、印跡膜蛋白面朝上，用ECL工作液均勻滴加至印跡膜使其完全覆蓋。ECL工作液使用量大約為0.125mL/cm²膜或根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)習(xí)慣使用。

4、用平頭鑷夾住印跡膜，垂直置于吸水紙以吸去自然流下的多余工作液，注意不能讓膜完全干掉。

5、快速將印跡膜置于二層保鮮膜之間，盡量趕盡氣泡。

6、將印跡膜蛋白面朝上，放于X光膠片暗盒內(nèi)。（如果用顯像儀器直接置于儀器中拍照即可）

7、在暗室內(nèi)放入X光片，曝光，顯影。如果在暗室中可肉眼看到比較亮的條帶，建議曝光1分鐘-3分鐘；如果肉眼看到的帶比較淡，建議曝光3-10分鐘；如果很淡或基本看不到帶，建議曝光10分鐘-30分鐘。

常見問題分析：

● 為什么會(huì)發(fā)生熒光淬滅？

抗原濃度太高，局部過多HRP會(huì)快速消耗底物，導(dǎo)致熒光信號(hào)過強(qiáng)，條帶呈灼燒樣?？山档涂乖蠘恿?。

操作時(shí)間過長(zhǎng)，膜逐漸干掉。避免膜干掉。

不良的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣導(dǎo)致設(shè)備或試劑污染。例如鐵銹和不慎沾染的顯影液、定影液，會(huì)造成熒光淬滅，甚至直接導(dǎo)致無熒光。

● 為什么會(huì)出現(xiàn)高背景？

抗體濃度過高，洗滌不充分，可以造成抗體在膜上的非特異結(jié)合，導(dǎo)致高背景?？赏ㄟ^降低抗體稀釋度，增加洗膜次數(shù)和Buffer用量，或在Wash Buffer中添加終濃度0.05%的Tween-20 加以改善。

封閉不充分，會(huì)造成抗體在膜上的非特異結(jié)合，導(dǎo)致高背景?？赏ㄟ^4℃封閉過夜或增加封閉液中的蛋白濃度加以改善。

使用了不恰當(dāng)?shù)姆忾]劑，可嘗試不同的封閉劑。

曝光過度，可減少底物顯色時(shí)間，縮短曝光時(shí)間。

操作過程中膜干了。確保膜完全浸沒于buffer 中，始終杜絕膜干。

● 膠片上條帶很濃怎么辦？

可減少蛋白上樣量；

降低一抗二抗稀釋度，減少抗體孵育時(shí)間；

如果背景深的話，則要把發(fā)光液瀝干些再壓片；如果背景不深則需減少發(fā)光時(shí)間和顯影時(shí)間。

● 膠片上條帶很弱是什么原因？

因?yàn)榈鞍咨蠘恿康突蚰康牡鞍自趤碓唇M織或細(xì)胞中的表達(dá)量并不豐富造成?？蛇m當(dāng)加大蛋白上樣量，也可通過提高抗體稀釋度或采用靈敏度更高的發(fā)光底物來調(diào)整。

蛋白沒有充分轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜后可通過預(yù)染Marker 判斷轉(zhuǎn)膜效率，也可用麗春紅染膜、用考馬斯亮藍(lán)染膠，判斷轉(zhuǎn)膜效率。

抗體效價(jià)不高，用量不足，孵育時(shí)間太短，或抗體反復(fù)使用保存不當(dāng)而失活。

可考慮更換效價(jià)更高的抗體，或提高抗體稀釋度，延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間；若懷疑抗體失活，可用斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)確定抗體活性。

曝光時(shí)間太短?？蛇m當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間。

● 出現(xiàn)非特異條帶是什么原因？

蛋白上樣量過大?？山档偷鞍咨蠘恿?。

一抗是多克隆抗體，或一抗、二抗?jié)舛忍??？筛鼡Q成單克隆抗體，或降低抗體濃度，縮短抗體孵育時(shí)間，優(yōu)化一抗和二抗的使用濃度。

洗膜不充分?？稍黾酉茨ご螖?shù)和Buffer用量，延長(zhǎng)洗膜時(shí)間，或在Wash Buffer中添加終濃度0.05%的Tween-20。

目的蛋白在體內(nèi)存在多種修飾形式，如乙?；?，甲基化，磷酸化，糖基化等?？刹殚單墨I(xiàn)，用合適的方法去除蛋白的修飾，或選擇合適的抗體。

目的蛋白降解。重新準(zhǔn)備蛋白樣品，并加入足夠的蛋白酶抑制劑。

● 如何判斷ECL 是否失效？

準(zhǔn)備ECL工作液1mL到一個(gè)干凈的EP管中，加入1μL未稀釋的HRP酶標(biāo)二抗到EP管中，混勻后即可看到管內(nèi)發(fā)出藍(lán)光，并在隨后的幾分鐘內(nèi)持續(xù)發(fā)光，表示底物活性正常。若不發(fā)光則說明ECL失效了。

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