Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus

-----MP Biomedicals New Zealand Limited

簡(jiǎn)述：

Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過(guò)Arthrobacter luteus(藤黃節(jié)桿菌)深層培養(yǎng)獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細(xì)胞細(xì)胞壁。該制劑是利用親和層析法部分純化獲得的凍干酶，其酶活單位是100,000 單位/g.其中主要負(fù)責(zé)裂解活酵母細(xì)胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過(guò)對(duì)ß-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產(chǎn)物主要是昆布五糖。

產(chǎn)品說(shuō)明：

單位定義：800nm條件下菌液吸光度下降30%，表示一個(gè)活力單位。

特異性：此產(chǎn)品的裂解譜包括以下屬的生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于細(xì)胞裂解、原生質(zhì)球形成及葡聚糖水解。

說(shuō)明:酵母細(xì)胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長(zhǎng)階段及培養(yǎng)條件而改變。

聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注冊(cè)商標(biāo)。

儲(chǔ)存:凍干狀態(tài)于2-8°C中保存，若30°C下放置3個(gè)月約失去90%活力。

外觀:凍干粉

活力：100,000單位/g

核心酶：ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶，約1.0 x 10⁷ 單位 /g

蛋白酶，約1.7 x 10⁴單位 /g

甘露聚糖酶, 約6.0 x 10⁴單位 /g

淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未檢出）

催化劑：二硫蘇糖醇（DTT）, ß-巰基乙醇及其他的巰基化合物（如半胱氨酸）

適pH及溫度：

pH 7.5, 35°C裂解活酵母細(xì)胞

pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范圍：pH 5-10間保持穩(wěn)定

熱穩(wěn)定性：60°C，5min喪失細(xì)胞溶解能力

警告：（1）Zymolase^Ø-100T溶解度低，以懸浮液的狀態(tài)使用。如果需制備濃度超過(guò)0.05%的無(wú)菌酶溶液，則通過(guò)將Zymolase^Ø-100T溶解在含5%葡萄糖的緩沖液中（pH 7.5），先配制2%的酶儲(chǔ)存液；（2）吸取懸浮液，留下沉至容器管底的任何物質(zhì)；（3）不推薦使用**纖維過(guò)濾器；（4）稀釋無(wú)菌的酶懸浮液至目標(biāo)濃度。

原生質(zhì)球制備程序：

1. 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養(yǎng)物；

2. 收集離心沉淀物（酵母細(xì)胞）并記錄濕重；

3. 用TE緩沖液懸浮細(xì)胞，加入量為1.4ml/g濕重細(xì)胞；（TE緩沖液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）

4. 雙蒸水快速定容，終體積量為3.5ml/g濕重細(xì)胞；

5. 按照17.5 ul (總體積的1/200)/ g濕重細(xì)胞的量加入ß -巰基乙醇（MP 806445），目的是為了除去細(xì)胞外層中的甘露聚糖層；

6. 30°C輕搖溫育混合液，處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的培養(yǎng)物處理15min，處于穩(wěn)定期生長(zhǎng)的培養(yǎng)物處理45min；

7. 室溫條件，5000rpm離心5min；

8. 用S緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加入量為4.0ml/g濕重細(xì)胞；（S緩沖液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5）

9. 5000rpm離心5min；

10. 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細(xì)胞）懸浮細(xì)胞，另外加入Zymolyases（50U /g濕重細(xì)胞）；如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液，則添加250ul即可。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況先優(yōu)化酶使用量。

11. 30°C輕搖溫育混合液30min，根據(jù)以下方式監(jiān)測(cè)原生質(zhì)球形成程度：

（1） 加1ul樣品到20ul S 緩沖液內(nèi)，原生質(zhì)球應(yīng)該保持完整；

（2） 加1ul樣品到20ul雙蒸水中，原生質(zhì)球應(yīng)該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個(gè)樣品的形態(tài)差異。

12．一般情況下反應(yīng)45-60min，原生質(zhì)球的形成量>90%，此時(shí)4^oC下離心收集細(xì)胞，5000rpm，5min；

13. 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細(xì)胞）懸浮原生質(zhì)球，5000rpm離心5min；重復(fù)此步驟做第二次清洗；；

14.原生質(zhì)球離心沉淀物-70^oC凍存。

裂解原生質(zhì)球獲取細(xì)胞核：

溫和的裂解原生質(zhì)球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll（MP 160003）溶液懸浮細(xì)胞離心沉淀物，F(xiàn)icoll溶解于含有0.5 mM CaCl₂ (MP 195088)的10 mM PIPES 緩沖液內(nèi)，pH 6.5。

酵母菌基因組DNA的制備：

以下步驟快捷，適合于從少量酵母培養(yǎng)物中制備基因組DNA ：

1. 將過(guò)夜培養(yǎng)的10ml酵母菌培養(yǎng)物離心收集細(xì)胞，加入280ul TE Buffer（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟3），300 ul雙蒸水，3 ul ß -巰基乙醇（MP 806445）；

2. 30^oC溫育45min；

3. 以臺(tái)式離心機(jī)的zui高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀物用500 ul S 緩沖液（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8）懸浮.；再次離心棄上清；

4. 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S緩沖液懸浮細(xì)胞沉淀物（或者使用自己認(rèn)為合適的酶濃度）；

5. 30^oC溫育1小時(shí)；

6. 重復(fù)步驟3；

7. 用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 緩沖液懸浮細(xì)胞沉淀物；

8. 37^oC溫育3小時(shí)，不時(shí)的混勻溶液；

9. 調(diào)水浴鍋的溫度至65^oC，并溫育20min；

10. 從水浴鍋內(nèi)取出并冷卻至室溫；

11. 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機(jī)內(nèi)取出并保留上清液；

12. 用200ul氯仿萃取上清液，之后重復(fù)漩渦混勻及離心；

13. 加入500ul95%乙醇到上清液內(nèi)，20^oC沉淀10min；

14. 4^oC下，15,000 xg離心20 min；

15. 自然風(fēng)干或者于真空離心蒸發(fā)濃縮器內(nèi)晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA;

16. 37^oC溫育1小時(shí)；

17. 重復(fù)步驟11和12；

18. 加入2.5倍體積的95%乙醇，20^oC沉淀10min；

19. 30ul雙蒸水重懸DNA。對(duì)1:500的DNA稀釋液測(cè)量A₂₆₀，根據(jù)消光系數(shù)計(jì)算DNA產(chǎn)量；

20. 產(chǎn)量大約為40-50ug。

附錄:

制備Zymolyase 100T溶液：

以下配制的溶液適用于該產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)程序中（但并不排除其他類型的母液也適用）

配制200單位/ml的母液，將凍干粉溶于已高壓滅菌的S緩沖液（配方見原生質(zhì)球制備程序中的步驟8）。

如果不被微生物污染，于4 ^oC下，此母液能2個(gè)星期以上時(shí)間內(nèi)保持；

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廠家說(shuō)明：

MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司是位于美國(guó)加利福尼亞州的知名生命科學(xué)和生物技術(shù)廠商。2004年底成功收購(gòu)Qbiogene、ICN，現(xiàn)在有5個(gè)大型倉(cāng)庫(kù)，能夠及時(shí)供應(yīng)各行業(yè)需求，倉(cāng)庫(kù)位于新加坡。它致力于生命科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和探索。目前它提供55000多種產(chǎn)品，是上能提供生命科學(xué)產(chǎn)品和臨床診斷產(chǎn)品的幾家廠商之一。

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