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 RT-112細胞

素爾細胞庫提供遺傳變異細胞系、正常組織來源細胞系、腫瘤細胞系、工程細胞系、干細胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長鼻袋鼠等。

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細胞培養(yǎng)的基本方法

一節(jié) 培養(yǎng)細胞的細胞生物學

一、基本概念通常，體外培養(yǎng)的生物成分無外乎兩種結構形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block），一般稱為外植塊；

其二是將生物組織分散后制成的單個細胞，一般稱為分離的細胞(isolated cell)或者分散的細胞(dissociated cell)。

分散的過程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進行，分散的細胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。

單個細胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細胞懸液(cell suspension)。

狹義的細胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離（散）細胞培養(yǎng)，廣義的細胞培養(yǎng)的概念還包括單（個）細胞培養(yǎng)(single cell culture)。一種是群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經(jīng)過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（clone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

現(xiàn)今，用于疫苗生產(chǎn)的細胞基本有3類，即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展，目前我國已經(jīng)擁有了可以進行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的動物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產(chǎn)技術，用于生產(chǎn)多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB17和2BS）對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，是當前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細胞基質(zhì)。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7%，可持續(xù)地進行培養(yǎng)，不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進行培養(yǎng)。該細胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產(chǎn)。RT-112細胞

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二、體外培養(yǎng)細胞的分型

（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：

1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。

3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。

4、多型細胞型：有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

（二）懸浮型:見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。RT-112細胞

三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程:體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞在體外的生存也不是的，存在著一個發(fā)展過程。所有這一切，使組織細胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。

（一）培養(yǎng)細胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng)，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養(yǎng)的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個階段：

1、原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。

2、傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時間長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當前上常用細胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。

3、衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，后衰退凋亡。

在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期 所有體外培養(yǎng)細胞，包括初代培養(yǎng)及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細胞數(shù)量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數(shù)量大、細胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數(shù)量大時細胞增殖速度比稀少時要快）。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞系比初代培養(yǎng)細胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。

所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。

細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：

1、潛伏期（Latent Phase）：細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續(xù)細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。

細胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成性細胞，還要經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。

2、指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細胞增值旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細胞一代中活力的時期，因此是進行各種實驗的和主要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（Piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應混淆。

3、停滯期（Stagnate Phase）：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時間，這是在實驗中應特別注意的。

四、原代培養(yǎng):即一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義：

培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；

原代培養(yǎng)中的“代”并非細胞的“代”數(shù)，因為培養(yǎng)過程中細胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細胞；

原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。

正常細胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞才能生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成。此細胞系一直延用至今。

原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞的生長就會出現(xiàn)停滯，大部分細胞衰老死亡。但是有少數(shù)的細胞能夠度過“危機”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會出現(xiàn)“危機”，不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c，有可能在培養(yǎng)條件下制地傳代下去，這種傳代細胞稱為細胞系。

RT-112細胞

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