在激發(fā)波長500nm，發(fā)射波長525 nm 附近，使用熒光顯微鏡/激光共聚焦檢測綠色熒光，從而測定組織內(nèi)活性氧水平。利用本試劑盒可以快速定性檢測樣本內(nèi)活性氧水平變化差異。

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冰凍切片活性氧(ROS)檢測試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR7814

產(chǎn)品組成：

保存條件：

DCFHDA探針-20℃避光保存；清洗液2-8℃保存。有效期6個月。

【注】：

● 探針開蓋前4℃/-20℃避光保存。長期不用可以-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

● 熒光探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁，注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

冰凍切片活性氧(ROS)檢測試劑盒產(chǎn)品簡介：

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括過氧化氫（H₂O₂，Hydrogen peroxide）、羥基自由基（?OH，Hydroxyl radical）、單線態(tài)氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧陰離子(?O2-，Superoxide anion)、過氧化自由基(ROO? ，Peroxyl radical)、過氧羥自由基（HOO? ，hydroperoxyl）及其下游產(chǎn)物過氧化物過氧亞硝基陰離子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生主要是氧化磷酸化的結(jié)果，在呼吸鏈中，在某些位點會有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應(yīng)，在酶或非酶作用下引發(fā)一系列反應(yīng)生成不同種類的活性氧：“泄露”的電子最初和氧氣反應(yīng)生成超氧陰離子自由基(O2·-)。超氧陰離子遇水生成H2O2，同時過氧化氫也可由氧氣在單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成，生成的過氧化氫在髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下與Cl-反應(yīng)可生成ClO-，在鐵或銅離子的催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)生成OH·，超氧陰離子遇氮氧化物反應(yīng)生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質(zhì)統(tǒng)稱為活性氧。

冰凍切片活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFHDA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFHDA本身沒有熒光，被活性氧特異性氧化生成綠色熒光物質(zhì)，綠色熒光強度與活性氧水平成正比，檢測綠色熒光就可以知道組織內(nèi)活性氧的水平。

在激發(fā)波長500nm，發(fā)射波長525 nm 附近，使用熒光顯微鏡/激光共聚焦檢測綠色熒光，從而測定組織內(nèi)活性氧水平。利用本試劑盒可以快速定性檢測樣本內(nèi)活性氧水平變化差異。

切片樣本的活性氧檢測一般最好使用振動切片或者新鮮的冰凍切片樣本。石蠟切片樣本的ROS在切片的的制作過程中會損失掉，有條件的話就使用振動切片或者冰凍切片樣本，一般不建議使用石蠟切片樣本。有條件的話也可以采用直接用組織樣本檢測，使用不需要制備成切片的ROS檢測試劑盒。

產(chǎn)品特點：

● 使用方便：可用熒光顯微鏡直接觀察；

● 背景低，靈敏度高；

● 線性范圍寬，使用方便。

檢測方法：

● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦顯微鏡

樣本類型：

● 新鮮冰凍切片 ● 振動切片

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● 離心機 ● 移液器 ● PBS

冰凍切片活性氧(ROS)檢測試劑盒使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

● 對于某些樣本，如果熒光太強，可以按照1:200-1:1000稀釋探針。探針標記的時間也可以根據(jù)情況在20-60分鐘內(nèi)適當進行調(diào)整。

● 以下操作步驟僅供參考，請根據(jù)實際樣本情況調(diào)整。

使用方法：

一、試劑配制

1、根據(jù)樣本數(shù)，用純水將DCFHDA活性氧熒光探針200-1000倍稀釋，配成染色工作液。

【注】：

● 不同樣本的活性氧差異較大，需要根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整稀釋倍數(shù)。一般染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-1000倍稀釋，最大可至10000倍稀釋，1000倍稀釋適合大多數(shù)樣本。

2、用純水將10×清洗液10倍稀釋，配成1×清洗液工作液。

二、探針標記

1、準備待測的厚為10-20μm的未經(jīng)固定處理的冰凍切片。

【注】：

● 必須使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時內(nèi)）制成的冰凍切片/振動切片。

● 否則不新鮮的樣本可能ROS已經(jīng)流失，檢測不到活性氧。

● 非新鮮樣本殘余的ROS也可以檢測到。

2、室溫下，小心加上200μL清洗液工作液，鋪滿整個切片表面，靜置5-10分鐘。

3、小心吸除清洗液。

4、滴加100μL染色工作液，在37℃培養(yǎng)箱避光孵育20-60分鐘。

【注】：

● 最好在濕盒中孵育，避免液體蒸發(fā)。

5、移除染色液。

6、用PBS洗滌切片2-3次。

7、加蓋玻片或甘油封片。

8、熒光顯微鏡檢測。

【注】：

● 染色完成后，立即進行熒光定性分析。

● 激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm。

● 熒光強，表明活性氧（ROS）含量高。

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