細(xì)胞培養(yǎng)的路上，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中，細(xì)胞點(diǎn)點(diǎn)，引無(wú)數(shù)英雄競(jìng)掛東南枝。正所謂“萬(wàn)事開頭難”，即便是細(xì)胞復(fù)蘇與保存這兩件看似簡(jiǎn)單的事情，也能造成實(shí)驗(yàn)汪內(nèi)心無(wú)比巨大的陰影面積。好在小魚這里有本細(xì)胞培養(yǎng)秘籍，可讓細(xì)胞這個(gè)熊孩子徹底變?yōu)槟愕馁N心小棉襖。

細(xì)胞復(fù)蘇步驟：

細(xì)胞凍存步驟：

其實(shí)，剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞就像是剛剛出生的baby，非常脆弱，需要各位小伙伴的細(xì)心呵護(hù)，不然，細(xì)胞就會(huì)被我們花樣玩死。為了避免細(xì)胞不明不白的掛掉，我們就要對(duì)細(xì)胞的各種習(xí)性了如指掌。

1. 俗語(yǔ)道，到什么山上唱什么歌，不同細(xì)胞用不同的培養(yǎng)液。此時(shí)，就不得不提起培養(yǎng)基里的“四大金剛”—MEM、DMEM、1640、F-12，它們基本參與了90%以上種類細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程。

MEM作為帶頭大哥，能力非常，號(hào)稱是應(yīng)用廣泛的細(xì)胞培養(yǎng)液。

DMEM作為隨時(shí)緊跟老大MEM的二弟，青出于藍(lán)而勝于藍(lán)，濃度要高出2~4倍，可分為高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。

老三1640中規(guī)中矩，營(yíng)養(yǎng)成分比較簡(jiǎn)單，比DMEM少一點(diǎn)糖和谷光甘肽，常用于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。

小兄弟F12常用來(lái)支持CHO、Hela和L－細(xì)胞生長(zhǎng)以及原代大鼠肝細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。MEM和F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，即可形成神經(jīng)生物學(xué)通用的培養(yǎng)基。

在此，奉送一個(gè)不同細(xì)胞系對(duì)應(yīng)的不同培養(yǎng)液的圖，供大家參考。

2. 細(xì)胞生長(zhǎng)的空間密度是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。具體養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)該摸索細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)空間密度，既不能讓細(xì)胞瓶里的細(xì)胞因擁擠不堪而萎靡不振；也不能讓細(xì)胞濃度低于1~5×10^5個(gè)/mL而導(dǎo)致“孤獨(dú)死”（因?yàn)榧?xì)胞的健康生長(zhǎng)需要細(xì)胞間的連接）。因而細(xì)胞接種前，要先通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)調(diào)整細(xì)胞濃度。

3. 當(dāng)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞形態(tài)不好時(shí)，可在傳代時(shí)，先倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無(wú)血清都可以）洗滌一次，用滴管吸走，再加入3ml培養(yǎng)基，沿著瓶底輕輕吹打一遍，然后吸走。這時(shí)在正式進(jìn)行消化、吹打。

其次，把吹打下的細(xì)胞懸液加入到含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況（10min，20min，30min）。而后迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次，然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及形態(tài)。直至找到細(xì)胞的形態(tài)為止。

4. 至于在培養(yǎng)瓶中加入多少培養(yǎng)基量，則是需要實(shí)驗(yàn)汪們自己去摸索的。對(duì)于生長(zhǎng)快的細(xì)胞，易生長(zhǎng)的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好，但是要注意對(duì)換液時(shí)間的把握。

5. 如何選擇培養(yǎng)瓶。一般，生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài)，那么采用塑料瓶會(huì)比玻璃瓶的效果好；生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞，用玻璃瓶培養(yǎng)的效果會(huì)更好。因此，對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長(zhǎng)速度慢的時(shí)候（比如細(xì)胞剛復(fù)蘇時(shí)或者原代培養(yǎng)），塑料瓶會(huì)好一點(diǎn)；而在其生長(zhǎng)旺盛的時(shí)候，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn)。

6. 細(xì)胞凍存時(shí)，蓋子要擰緊，不然復(fù)蘇水浴時(shí)會(huì)滲水，造成細(xì)胞污染。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子、型號(hào)的管子會(huì)有差別），蓋子擰緊后用封口膜封住。且每支凍存管都要標(biāo)上細(xì)胞的名稱、凍存時(shí)間，并記錄在冊(cè)，以免后續(xù)復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，取錯(cuò)細(xì)胞。

7. 細(xì)胞凍存時(shí)要嚴(yán)格進(jìn)行梯度降溫（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火兩重天的生活環(huán)境只會(huì)讓嬌弱的細(xì)胞自爆身亡，謹(jǐn)記：緩降溫！但如果真心趕時(shí)間時(shí)，可以使用細(xì)胞凍存盒進(jìn)行細(xì)胞凍存，而后盡快將其轉(zhuǎn)入液氮中。此外，要定期測(cè)量液氮罐里的液氮儲(chǔ)備，以保證細(xì)胞全部浸在液面下。

8. 細(xì)胞解凍時(shí)，由于凍存管管壁較厚、隔熱，而導(dǎo)致水浴時(shí)間太長(zhǎng)（2min還沒(méi)融化）時(shí)，可以將水浴鍋的溫度調(diào)至40℃左右，可以縮短解凍時(shí)間。

9. 提前預(yù)定超凈臺(tái)，減少?gòu)?fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間，可避免細(xì)胞房人滿為患，超凈臺(tái)使用緊張，復(fù)蘇1h后，還沒(méi)有加入新的培養(yǎng)液。（高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞，但復(fù)蘇融解后，浸泡時(shí)間太久會(huì)對(duì)細(xì)胞有毒性）

10. 復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)一定要有耐心，因?yàn)橛行┘?xì)胞在復(fù)蘇一星期后才會(huì)真正有起色。因而，盡管細(xì)胞在復(fù)蘇三四天后沒(méi)有任何動(dòng)靜，也不要輕易倒掉所有細(xì)胞，要耐心等待，兩周后再做決定。

11. 有關(guān)DMSO的一些注意事項(xiàng)：

?(1) DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩凍存過(guò)程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)的離子濃度、減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷程度。

?(2) DMSO在溶解過(guò)程中會(huì)放熱，應(yīng)先與培養(yǎng)基混勻后再加血清，同時(shí)凍存液提前配置，DMSO現(xiàn)配對(duì)細(xì)胞的毒性可能更大；

?(3) 復(fù)蘇時(shí)，要離心去除DMSO，并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌1-2次，注意離心的時(shí)候速度不要太快。