實(shí)時(shí)熒光定覺(jué)PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加人熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板進(jìn)行定量分析的方法。
    實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀常用的檢測(cè)模式有TaqMan/TaqMan MGB探針?lè)ê蚐YBR Green I熒光染料法。

    TaqMan技術(shù)要點(diǎn)是在普通PCR原有的一對(duì)特異性引物的基礎(chǔ)上增加了一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針.該探針同樣與核酸特異性結(jié)合.且結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域的中間.探針的5'端和3'端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5'端標(biāo)記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測(cè)儀器接收，稱為報(bào)告熒光基團(tuán);3'端一般標(biāo)記TAMRA熒光素，它在近距離內(nèi)能吸收5'端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，稱為淬滅熒光墓團(tuán).當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時(shí)，一對(duì)引物和一條探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，探針位于引物之間。此時(shí)探針5'端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被3'端的淬滅熒光基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)。當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí).Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種核昔酸為底物，根據(jù)堿基配對(duì)的原則.沿著模板鏈合成新鏈。當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時(shí)，受到探針的阻礙而無(wú)法繼續(xù).此時(shí)的Taq酶發(fā)揮它的5'-3'外切核酸酶的功能，將探針切成單核昔酸，消除阻礙，將鏈延伸過(guò)程進(jìn)行到底，合成新鏈，而被水解的探針.其5'端和3'端的熒光素此時(shí)均游離于溶液中，5'端標(biāo)熒光素發(fā)出的熒光信號(hào)不再被3'端的淬滅熒光基團(tuán)吸收，熒光信號(hào)即被儀器接收.PCR進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，合成了多少條新鏈就水解了多少條探針，釋放了相應(yīng)數(shù)目的熒光基團(tuán)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著PCR過(guò)程的進(jìn)行.重復(fù)上述過(guò)程, PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)(圖5-3).
   與上述TaqMan探針相比，TaqMan MGB探針有兩個(gè)主要不同:一是探針3'端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光素標(biāo)記。這使熒光本底降低.熒光光分辨率得以大大改善。二是探針3'端另結(jié)合T MGB(minor groove binder)結(jié)合物，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性，使結(jié)果、分辨率高。
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