真菌 酵母尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性光譜法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

真菌/酵母尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP glucose pyrophosphorylase）活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶連續(xù)反應系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）還原后峰值的增高，即采用光譜法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種真菌/酵母細胞裂解懸液樣品尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶（uridine 5'-diphosphoglucose pyrophosphorylase；UDP glucose pyrophosphorylase；UGPase；EC2.7.7.9），又稱三磷酸尿苷葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase），是碳水化合物代謝中的主要酶蛋白，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞的胞漿里。在真核生物中，其氨基酸序列達55%同源。尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶主要催化葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate）和三磷酸尿苷（UTP）反應產(chǎn)生尿苷二磷酸葡萄糖（UDP glucose）和無機焦磷酸（pyrophosphate）的可逆反應。其功能在于通過核糖（nucleotide sugar）的UDP葡萄糖，作為糖苷基供體（glycosyl donor）和各種糖體分子前體（presursor），參與糖原、蔗糖、纖維素、糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖以及酵母和植物細胞壁的生物合成。基于底物尿苷二磷酸葡萄糖和無機焦磷酸，通過尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶（phosphoglucomutase；PGM）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase；G-6-PDH）反應系統(tǒng)，測定氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）所產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm 波長），來定量分析尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶的活性。尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶反應系統(tǒng)為：

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）    毫升

強化液（Reagent B）  毫升

緩沖液（Reagent C）  毫升

底物液（Reagent D）  毫升

反應液（Reagent E）    毫升

陰性液（Reagent F）    毫升

產(chǎn)品說明書  1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent A）、底物液（Reagent D）和反應液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應孵育

比色皿或酶標板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光譜分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent A）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

一、 樣品準備

 

1． 準備好10毫升待測的新鮮真菌/酵母細胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升）

2． 移入到預冷的15毫升錐形離心管

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管

8． 加入xx微升強化液（Reagent B）

9． 強力渦旋震蕩15秒

10． 置于冰槽里1分鐘

11． 重復實驗步驟9至10五次

12． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

13． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

 

二、 測定準備

 

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent D）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

三、 背景對照測定

 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

四、 樣品測定

 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

 

五、計算樣品活性

 

六、 酶標板測定

 

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔中

3． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升反應液（Reagent E）

5． 輕輕搖動96孔酶標板

6． 在37℃溫度下孵育3分鐘

7． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

8． 輕輕搖動酶標板

9． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)

10． 活性計算

 

 

注意事項

 

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議使用比色皿測定

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 強化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1毫升槍頭，將部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿；或秤重0.1克

7． 加樣后3秒內(nèi)光譜測定

8． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)30分鐘

9． 光譜測定后，比色皿須清洗徹底

10． 樣本測定30分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11． 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）

12． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

13． 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列生化酶學檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感