細(xì)胞裂解的方法你知道嗎?

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  對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品:

  1.融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的Zui終濃度為1mM.

  2.對于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會被裂解.

  對于是浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔L板每孔細(xì)胞加入150-250微升烈解液的比例加入裂解液再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。

  3.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Wester和免疫沉淀等操作.烈解液用量說明:通常63板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。

  在試驗(yàn)中，不同的細(xì)胞采用不同的裂解方法。如研磨，細(xì)胞勻漿，TritonX 100，稀減法等等。那么，具體該怎樣選擇細(xì)胞的裂解方法? 本節(jié)內(nèi)容主要圍繞組織樣本裂解細(xì)胞的方法做詳細(xì)介紹。

  1.把組織剪切成細(xì)小的碎片

  2.融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。

  3.按照每20室克組織加入150-250微升烈解液的比例加入烈解液。(如果烈解不充分可以適當(dāng)添加多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)

  4.用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解

  5.充分烈解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作.

  6.如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分，然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

  注:RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappab、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

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