古朵帶您了解哪些指標(biāo)評估來判斷ELISA試劑盒的質(zhì)量呢

  01  特異性

  特異性簡單來說就是陰性樣本的陰性檢出率，要保證這一點(diǎn)首先就需要做到與其他檢測抗體(原)無交叉感染，并且保證陰性樣本檢出的準(zhǔn)確性。

  02  靈敏度

  靈敏度簡單來說就是陽性樣本的陽性檢出率，一方面能夠反映出試劑盒對于被檢物質(zhì)的低檢測能力，另一方面需要保證陽性樣本檢出的準(zhǔn)確性?？赏ㄟ^我們自身待檢物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行選擇，如果我們待檢物質(zhì)濃度量很低，可以選擇高靈敏的試劑。

  03  性

  又可稱作重復(fù)性，一般而言，對于ELISA試劑盒而言，板間及板內(nèi)性可控制在15%以內(nèi)。有些ELISA試劑盒性可達(dá)到10%以內(nèi)。

  04  穩(wěn)定性

  穩(wěn)定性是試劑盒必須有的基本屬性，是指試劑(盒)在有效期內(nèi)和規(guī)定條件下保持其性能的能力，一般有效期穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、以及凍融穩(wěn)定性。

  05  操作簡便性

  同樣對于ELISA的操作簡便程度大家也是非常關(guān)心的，操作時(shí)間以及操作步驟也是我們在選擇試劑盒過程中需要考慮的問題。

  二、取材方法及注意事項(xiàng)

  a、液體樣本 液體樣本處理原則：所有的液體樣本，用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，如果以后遇到其他的液體樣本，也按這個(gè)方法，納入?yún)R總表。

  1、血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

  2、血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

  3、尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  4、胸腹水：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  5、腦脊液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  6、唾液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  7、細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  8、牛奶：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  9、蜂蜜：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。10、全血：用含有抗凝劑的無菌管收集，立即輕輕搖動(dòng)，來回輕輕顛倒數(shù)次，使血液和抗凝劑混勻，以防血液凝固。

  b、固體樣本 固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測，細(xì)胞內(nèi)的蛋白，要先收集細(xì)胞，再用合適方法破碎，離心取上清測試。

  1、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對于植物組織，不好勻漿的話，就在液氮中充分研磨;

  2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。(1)培養(yǎng)的細(xì)胞A、動(dòng)物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融(如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎)，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。B、植物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。(2)組織的細(xì)胞切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。

  3、土壤：稱取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標(biāo)本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

  4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

  5. 植物標(biāo)本的精采集及保存1、稱取0.1g(誤差±3%以內(nèi))新鮮植物組織樣本，在液氮中充分研磨;2、加入1ml的提取液(80%甲醇),置于-20度過夜;3、于4度，8000rpm，離心1小時(shí)，取上清;4、上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇(1ml)平衡柱上樣收集樣品移開樣品后用甲醇(5ml)洗柱(5ml)洗柱甲醇(5ml)洗柱循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮?dú)獯蹈?，保存?zhèn)溆?5、上樣前加入pH7.4PBS緩沖液(1ml定容)?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，然后4度離心(8000rpm，15分鐘)，取上清并暫時(shí)保存于4度待用。

  c.植物標(biāo)本中相關(guān)酶或蛋白的測定：(粗提取)

  1、新鮮植物組織請?jiān)谝旱谐浞盅心?

  2、加入樣品體積9倍的提取液(pH7.4PBS緩沖液);

  3、請于4度，8000rpm，離心30分鐘，取上清并暫時(shí)保存于4度待用。

  三、樣本收集注意事項(xiàng)

  1、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。2、標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

  3、我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實(shí)驗(yàn)人員多參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，自行設(shè)計(jì)合理的樣本處理方法。

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