軟瓊脂細(xì)胞克隆試劑盒檢驗(yàn)的步驟說(shuō)明

  軟瓊脂細(xì)胞克隆試劑盒特別適用于動(dòng)物或人體轉(zhuǎn)化型體細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)一致。

  實(shí)驗(yàn)步驟如下：

  實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的所有試劑溶液放進(jìn)37℃恒溫水浴里預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

  一、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2)操作

  1. 將克隆液(Reagent A)置于微波爐里加熱溶化(注意：避免溢出)

  2. 放進(jìn)50℃恒溫水浴

  3. 移出15毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液(Reagent B)到50毫升錐形離心管

  4. 移出15毫升克隆液(Reagent A)到50毫升錐形離心管

  5. 輕度渦旋震蕩或用手搖動(dòng)錐形離心管，充分混勻

  6. 快速度分別移入3毫升(每個(gè)3毫升)到10個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶

  7. 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿(mǎn)整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

  8. 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

  9. 準(zhǔn)備1瓶25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞，清洗，脫落，計(jì)數(shù)

  10. 移出1毫升(總量為2500個(gè)細(xì)胞)到15毫升錐形離心管

  11. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

  12. 小心抽去上清液

  13. 加入2.25毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液(Reagent C)，用槍頭上下輕柔抽吸混勻(注意：用戶(hù)可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)

  14. 加入750微升克隆液(Reagent A)，用槍頭上下輕柔抽吸混勻

  15. 快速度全部移入到1個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶里，置于已凝固的膠體上面

  16. 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿(mǎn)整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

  17. 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

  18. 放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育

  19. 次日，輕輕加入3毫升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面(注意：用戶(hù)可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)

  20. 1周后，再次加入3毫升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面

  21. 2周后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞：細(xì)胞集落形成能力和效率(Clonogenicity/Efficiency)，包括細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小，以及貼壁非依賴(lài)型生長(zhǎng)等

  22. (選擇步驟)小心抽去低養(yǎng)液(Reagent D)

  23. (選擇步驟)用細(xì)胞刮脫棒小心刮落含有細(xì)胞集落的中養(yǎng)層

  24. (選擇步驟)用1000微升槍頭(翦去頂端部分)吸出細(xì)胞集落

  25. (選擇步驟)加入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶

  26. (選擇步驟)加入3毫升用戶(hù)自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

  27. (選擇步驟)用5毫升移液管抽吸，充分打碎細(xì)胞集落

  28. (選擇步驟)放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育

  二、細(xì)胞培養(yǎng)板(12孔板)操作

  1. 將克隆液(Reagent A)置于微波爐里加熱溶化(注意：避免溢出)

  2. 放進(jìn)50℃恒溫水浴

  3. 移出10毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液(Reagent B)到50毫升錐形離心管

  4. 移出10毫升克隆液(Reagent A)到50毫升錐形離心管

  5. 輕度渦旋震蕩或用手搖動(dòng)錐形離心管，充分混勻

  6. 快速度分別移入1.5毫升(每孔1.5毫升)到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔里

  7. 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿(mǎn)整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

  8. 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

  9. 準(zhǔn)備1瓶25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞，清洗，脫落，計(jì)數(shù)

  10. 移出1毫升(總量為2500個(gè)細(xì)胞)到15毫升錐形離心管

  11. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

  12. 小心抽去上清液

  13. 加入1.125毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液(Reagent C)，用槍頭上下輕柔抽吸混勻(注意：用戶(hù)可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)

  14. 加入375微升克隆液(Reagent A)，用槍頭上下輕柔抽吸混勻

  15. 快速度全部移入到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔里，置于已凝固的膠體上面

  16. 用手輕輕抖動(dòng)，鋪滿(mǎn)整個(gè)底面，避免氣泡產(chǎn)生

  17. 置于室溫下至少2小時(shí)，使膠體凝固

  18. 放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育

  19. 次日，輕輕加入500微升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面(注意：用戶(hù)可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)

  20. 1周后，再次加入500微升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面

  21. 2周后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞：細(xì)胞集落形成能力和效率(Clonogenicity/Efficiency)，包括細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小，以及貼壁非依賴(lài)型生長(zhǎng)等

  22. (選擇步驟)小心抽去低養(yǎng)液(Reagent D)

  23. (選擇步驟)用細(xì)胞刮脫棒小心刮落含有細(xì)胞集落的中養(yǎng)層

  24. (選擇步驟)用1000微升槍頭(翦去頂端部分)吸出細(xì)胞集落

  25. (選擇步驟)加入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔里

  26. (選擇步驟)加入3毫升用戶(hù)自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

  27. (選擇步驟)用5毫升移液管抽吸，充分打碎細(xì)胞集落

  28. (選擇步驟)放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育

  軟瓊脂細(xì)胞克隆試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專(zhuān)門(mén)從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷(xiāo)售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷(xiāo)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿(mǎn)足客戶(hù)的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶(hù)需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶(hù)滿(mǎn)意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒