間接免疫熒光法檢測自身抗體

  自身抗體診斷的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是間接免疫熒光法，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，陽性與陰性樣品的信號(hào)強(qiáng)度對比明顯，通過顯微鏡觀測能夠地判斷組織或細(xì)胞內(nèi)熒光的分布。自身抗原的位置決定了其相應(yīng)抗體的典型的熒光模式，所有與此典型模式不相關(guān)區(qū)域的染色被認(rèn)為是非特異性染色。即使偶爾伴有強(qiáng)的非特異性染色，但弱的特異性信號(hào)也能夠被識(shí)別。間接免疫熒光法不需要復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的化學(xué)制備程序，而酶聯(lián)免疫吸附測定等實(shí)驗(yàn)，要取得高特異性則必須提取和純化抗原，并將其吸附于固相載體上，如果抗原不純，則相關(guān)抗體會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 間接免疫熒光法保留了原基質(zhì)的完整抗原譜，因而可同時(shí)檢測大量抗體.獲得較高的檢測效率。當(dāng)抗幾種不同抗原的抗體需要在一種生物基質(zhì)上同時(shí)檢測時(shí)(如抗細(xì)胞核抗原抗體)，或?yàn)槊恳环N實(shí)驗(yàn)逐一準(zhǔn)備抗原很困難或相當(dāng)復(fù)雜時(shí)，就應(yīng)該選擇免疫熒光法。另外，應(yīng)用免疫熒光法還可檢測到一些至今未知的抗體。

  在沒有熒光顯微鏡時(shí)，可嘗試用酶標(biāo)記的第二抗體代替熒光標(biāo)記的抗體，但是檢測的質(zhì)量會(huì)明顯下降。因?yàn)樵诿庖邿晒夥ㄖ?，指示劑染色是通過抗體直接結(jié)合在細(xì)胞抗原上產(chǎn)生的，而免疫酶法，染色則是彌散地圍繞在抗原周圍的區(qū)域。因此免疫酶法并不總是像免疫熒光法那樣能區(qū)分抗原分布的細(xì)小差別。而且應(yīng)用酶染色時(shí)，會(huì)導(dǎo)致許多自身抗體不能被區(qū)分或根本測不到。僅應(yīng)用細(xì)胞核制備物免疫酶染色的純光度法評價(jià)也是不可取的，因?yàn)檫@不可避免地導(dǎo)致一些自身抗體被漏檢。

  實(shí)驗(yàn)室工作者需要經(jīng)過一定的專業(yè)訓(xùn)練并不斷實(shí)踐，方可勝任熒光顯微鏡下的讀片工作。顯微鏡下的結(jié)果判斷，為綜合知識(shí)的體現(xiàn)，到目前為止，尚沒有任何儀器可取代人工讀片。

  (一)實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的選擇和血清的稀釋度

  1.實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的選擇用間接免疫熒光法對自身抗體進(jìn)行測定的效果，在很大程度上取決于基質(zhì)的質(zhì)量(包括基質(zhì)本身的質(zhì)量及制備的質(zhì)量)。這些實(shí)驗(yàn)基質(zhì)，通常是用動(dòng)物或人類的細(xì)胞或組織，經(jīng)一系列方法進(jìn)行處理，如Hep-2細(xì)胞的培養(yǎng)、吸附和固定，玲凍組織切片的制備、貼片等。國內(nèi)不少實(shí)驗(yàn)室仍在自制實(shí)驗(yàn)基質(zhì)，這已越來越不適應(yīng)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、現(xiàn)代化的需要，建議應(yīng)盡可能選擇生產(chǎn)工藝、質(zhì)控措施嚴(yán)格的商品化試劑盒，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。檢測不同的自身抗體應(yīng)選擇不同來源的實(shí)驗(yàn)基質(zhì)(不同動(dòng)物的不同組織)。

  2.血清的稀釋度 一般來講，一個(gè)待測標(biāo)本，要測定某種或多種自身抗體，通常需要先測定一個(gè)起始稀釋度。如該稀釋度的檢測結(jié)果為陰性，則認(rèn)為該抗體或多種抗體不顯著存在(無臨床價(jià)值)，通常無需稀釋標(biāo)本做進(jìn)一步檢測。如果該稀釋度的檢測結(jié)果為陽性，則認(rèn)為該抗體明顯存在(可能有臨床意義)，可將標(biāo)本做進(jìn)一步稀釋，以獲得該抗體的滴度。因此確定待測標(biāo)本合適的起始稀釋度，顯得十分重要。由于待測血清的起始稀釋度是結(jié)合臨床統(tǒng)計(jì)所得，而不同的實(shí)驗(yàn)室采用的方法學(xué)有差異，故不同實(shí)驗(yàn)室的血清起始稀釋度可能不同。另外，為了避免前帶現(xiàn)象的發(fā)生，有時(shí)對可疑的陰性標(biāo)本，尚需進(jìn)一步的稀釋后進(jìn)行測定。

  (二)實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化滴定平板技術(shù)

  實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化流程為滴加樣品、標(biāo)記抗體至加樣板，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時(shí)，載片上的所有生物薄片均與液滴接觸，反應(yīng)同時(shí)開始。因?yàn)橐后w被局限在一封閉的空間，不再需要傳統(tǒng)“濕盒"，可同時(shí)在一致的反應(yīng)條件孵育大量的標(biāo)本。下面以間接免疫熒光法為例，介紹滴定平板技術(shù)的操作過程：

  1.準(zhǔn)備 檢查加樣板：觀察是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水，如果不是，用濕紙巾擦干凈，隨后從試劑盒中取出載片，等平衡至室溫時(shí)方可打開包裝。注意不要觸摸生物薄片，用筆編號(hào)、標(biāo)記。

  2.稀釋血清 根據(jù)使用者實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用PBS-Tween緩沖液稀釋血清，每次實(shí)驗(yàn)均需陽性、陰性對照，使用前要混勻。

  3.加樣 按順序分別滴加25ul稀釋后血清至加樣板每一反應(yīng)區(qū)，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標(biāo)本后再開始溫育。

  4.步溫育 將載片貼有基質(zhì)的一面朝下蓋在加樣板的凹糟里，反應(yīng)即開始。室溫下溫育30分鐘。

  5.沖洗 用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗載片1秒鐘(注意水流不要太急，不要直接對著基質(zhì))，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯，浸洗至少1分鐘。

  6.加樣滴加20ul異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白至一潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)，加完方可繼續(xù)溫育。異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗人球蛋白使用前需混勻，用PBS-Tween緩沖液稀釋。

  7.第二步溫育從PBSTween緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦干背面和邊緣后，立即蓋在加樣板上，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)。注意避免陽光直接照射載片，室溫溫育30分鐘。

  8.沖洗用燒杯盛PBS—Tween緩沖液流水沖載片1秒鐘(水流不要太急，不要直接對著基質(zhì))，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少1分鐘。

  9.封片加甘油/PBS至蓋玻片，每一反應(yīng)區(qū)約10ul。從pBS-Tween緩沖液取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間鯨。將蓋玻片輕輕蓋在載片上。

  10.結(jié)果判斷 熒光顯微鏡下觀察熒光。

  (三)抗體檢測的質(zhì)量控制及注意事項(xiàng)

  l.質(zhì)量控制 自身抗體檢測的質(zhì)量控制是用多種手段對自身抗體存在與否、濃度的多少進(jìn)行控制和評價(jià)，有利于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部、實(shí)驗(yàn)室之間對同一標(biāo)本獲取相同具有可比性的結(jié)果，是衡量實(shí)驗(yàn)室檢測水平的一個(gè)重要指標(biāo)。然而.自身抗體檢測的質(zhì)量控制，并不是一件容易的工作。因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室所用的抗原基質(zhì)存在差異、抗原的固定方法有差異或不同，血清的稀釋方法不同以及操作者對不同熒光模式的識(shí)別能力不同等，均可影響到自身抗體的檢酒質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行臨床檢測時(shí)，應(yīng)同時(shí)檢測陽性對照、陰性對照，以監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。國內(nèi)急需成立專門的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)，參照標(biāo)準(zhǔn)，與接軌，建立自己當(dāng)?shù)氐臉?biāo)準(zhǔn)，開展自身抗體檢測的質(zhì)量控制。

  2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)(兩級測定) 間接免疫熒光法，提供了對自身抗體進(jìn)行篩選的理想途徑。許多情況下，僅使用該方法就可為臨床提供足夠的診斷信息，不需要做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在自身抗體的檢測中，稱間接免疫熒光法為“水平1測定"。如果有必要對自身抗體進(jìn)行進(jìn)一步的單特異性區(qū)分，則可應(yīng)用其他方法，如酶免疫測定法、對流免疫電泳及免疫雙擴(kuò)散法等，稱這些實(shí)驗(yàn)為“水平2測定。酶免疫測定法所用的抗原必須為純化的。許多抗原不易被純化，且很多自身抗體的確切抗原至今未知。故目前只有一小部分用HEp-2細(xì)胞柱測到的抗體及小部分組織抗體，進(jìn)行進(jìn)一步單特異性檢測。然而抗體的終區(qū)分，需要使用純化的抗原作為實(shí)驗(yàn)基質(zhì)。單獨(dú)的“水平2"測定，不能適應(yīng)自身抗體檢測的需要。特別是對抗核抗體的測定，單做“水平2"測定將會(huì)漏掉某些自身抗體，故必須同時(shí)用免疫熒光法進(jìn)行檢測。

  3.實(shí)驗(yàn)報(bào)告及解釋

  (1)陰性：在整個(gè)檢測系統(tǒng)(包括各種質(zhì)控)正常的情況下，當(dāng)待檢標(biāo)本在合適的起始稀釋度下，實(shí)驗(yàn)基質(zhì)沒有明顯的熒光染色，或沒有可辨認(rèn)的熒光模型時(shí)，稱此待檢的血清樣本的某種自身抗體陰性。

  (2)陽性：整個(gè)檢測系統(tǒng)(包括各種質(zhì)控)正常的情況下，當(dāng)血清待檢標(biāo)本在合適的起始稀釋度下，產(chǎn)生明顯高于陰性對照的特異熒光，且有明鮮可以辨認(rèn)的熒光模式，稱此待檢血清標(biāo)本的某待檢抗體陽性。

  注意，有時(shí)申請報(bào)告中，申請檢測的自身抗體結(jié)果為陰性，而發(fā)現(xiàn)其他自身抗體為陽性。在這種情況下，如果該檢測到的自身抗體有明顯的臨床意義，則要報(bào)告此結(jié)果。如該自身抗體無明確臨床意義，則可不報(bào)告，以避免造成混亂。但如果臨床醫(yī)生與實(shí)驗(yàn)室工作者進(jìn)行研究合作，則可報(bào)告或另外進(jìn)行交流。

  (3)免疫熒光模式;對陽性結(jié)果應(yīng)報(bào)告其熒光模式，以初步提供自身抗體針對的靶抗原特異性，為進(jìn)一步進(jìn)行“水平2"檢測提供信息。

  (4)滴度：滴度的定義為：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清比較，能觀測到的特異性的熒光反應(yīng)的高稀釋度。檢測結(jié)果應(yīng)該報(bào)告滴度，為臨床提供動(dòng)態(tài)的信息，因?yàn)樽陨砜贵w陽性患者，在診斷和治療過程中，要做多次檢測，且有些自身抗體的滴度與病情密切相關(guān)。

  抗體 抗原 染色液 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。