三色多重?zé)晒馊旧噭┖?雙標(biāo)三色)

  原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ，TSA技術(shù)同樣采用HRP標(biāo)記的二抗，同樣有對應(yīng)的“顯色”步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物，重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復(fù)就可實現(xiàn)多重標(biāo)記。

  TSA詳細(xì)原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設(shè)計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為一下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現(xiàn)單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

  三色多重?zé)晒馊旧噭┖?試劑盒組成：TYR-520熒光染料(綠光)(即用型，5mL),-20℃;TYR-570熒光染料(紅光)(即用型，5mL)，-20℃; TSA+增強劑，50ul， -20℃(可選);

  高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(10mL) 4℃。

  備注：TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 在-20度下 ，均為固體，使用之前需解凍。

  TSA+增強劑 使用方法：TSA+增強劑 能夠進(jìn)一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

  操作流程：

  1  石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風(fēng)廚內(nèi)，酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。

  2  抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定)。

  3  阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

  4  BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

  5  加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

  6  加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。

  7  熒光染料反應(yīng)：TYRXXX熒光染料反應(yīng) 2min-15min，PBS洗三次。

  8  重復(fù)2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

  9  DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

  10  封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

  11  鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

  染料激發(fā)波長發(fā)射波長

  DAPI 藍(lán)色350420

  TYR-480450480

  TYR-520綠色490520

  TYR-570紅色550570

  TYR-620590620

  TYR-690630690

  TYR-780750780

  文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Three-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

  三色多重?zé)晒馊旧噭┖?上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。