免疫熒光雙標技術(shù)中操作要點和注意事項

  一、免疫熒光的標本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點如下：

  1. 免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。

  2. 免疫熒光的二抗使用不同熒光標記的二抗孵育，孵育時間根據(jù)抗體的工作濃度確定。

  3. 二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

  4. 免疫熒光在封片使用專用封片劑或甘油：0.01MPBS (1：1)。

  5. 條件許可可以購買防淬滅的試劑加入封片劑中，標本可以保存久。

  6. 熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光。

  7. 熒光抗體染色假陽性可能會多，需要設(shè)定陽性和陰性對照。

  二、注意事項

  1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。

  2. 每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：

  (1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物

  (2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物

  (3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物

  三、免疫熒光雙標的經(jīng)驗之談

  1. 選取primary antibodies時要來源于兩種不同的動物，用來源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號標記的，用donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。

  2. 我的做法是兩種primary antibodies同時孵育，然后兩種secondary antibodies同時孵育?？贵w濃度、孵育時間要認真摸索，感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較干凈。

  3. 我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。

  4. Block用的血清使secondary antibody來源動物的血清，我的是10%正常donkey血清。

  5. 其余同一般操作。

  免疫熒光雙標 古朵 上海古朵生物科技有限公司，由具有資深行業(yè)背景和豐富市場經(jīng)驗的專業(yè)人士組成，致力于為生命科學研究領(lǐng)域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。既能滿足研發(fā)類客戶對產(chǎn)品種類、包裝、純度的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個階段的綜合需求。產(chǎn)品涵蓋有機試劑、無機試劑和生化試劑，標準物質(zhì)、天然植物提取物及中藥標準品，核酸、酶、緩沖劑、顯色底物，醫(yī)藥中間體、原料藥、催化劑、高純?nèi)軇?、特種高分子材料及實驗室常用耗材。品種類超過2萬種，廣泛應(yīng)用于細胞藥理、藥劑、分子生物學等科研領(lǐng)域。