基因人近收到不少老師和同學(xué)們對水平電泳的小疑惑——TAE和TBE兩個緩沖液有什么區(qū)別??？100bp的DNA用多少濃度的膠檢測??？水平電泳一般用多大電壓跑啊？……

是時候給大家講講水平電泳的那些小問題了！不過估計大多數(shù)人都知道，不用再看了。

1 電泳方式

用于分離核酸的凝膠電泳可分為垂直型和水平型。垂直型電泳，一般用聚丙烯酰胺作為支撐物。水平型電泳，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，也稱為潛水式，一般使用瓊脂糖作為支撐物?？筛鶕?jù)待檢測核酸分子的大小，選擇電泳方式。

目前使用多的還是水平型電泳。因制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可根據(jù)需要制備不同規(guī)格大小的凝膠，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。

2 電泳凝膠濃度與檢測分子量大小的關(guān)系

在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，DNA片段遷移距離和其含有的堿基對數(shù)量呈反比，因此可通過與標(biāo)準(zhǔn)條帶（Marker）遷移距離進(jìn)行比較，由此得出目的條帶的大小。但此檢測方法，僅對雙鏈線性DNA比較準(zhǔn)確（DNA Marker一般為雙鏈線性DNA）。

同樣的線性DNA分子在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，DNA電泳遷移率的對數(shù)和瓊脂糖凝膠濃度呈線性關(guān)系，凝膠濃度的選擇取決于待檢測的DNA分子大小。小分子DNA應(yīng)選擇對應(yīng)濃度的PAGE凝膠電泳完成檢測，而大的DNA分子建議使用脈沖場凝膠電泳。

3 核酸分子構(gòu)象與電泳遷移率的關(guān)系

DNA分子在電場中的遷移速度不僅和分子量有關(guān)，還和它本身的構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線性、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中的移動速度是不一樣的。移動速度次序為：共價閉環(huán)DNA>線性DNA>開環(huán)DNA。

當(dāng)瓊脂糖濃度太大時，環(huán)狀的DNA一般不能進(jìn)入膠內(nèi)，而停留在樣品孔中。

4 電泳電壓的確定

在低電壓時，線性DNA片段的遷移速率和所加電壓呈正比。電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。

電泳時，電壓建議為5-8V/cm。電壓過低會導(dǎo)致條帶彌散；電壓過高會使凝膠過熱和DNA變性，還可能出現(xiàn)條帶彎曲等帶型，影響檢測結(jié)果。

5 TAE與TBE緩沖液的選擇

TAE緩沖液推薦用于分析分子量大于1500bp的DNA片段和超螺旋DNA條帶；TBE緩沖液推薦用于分析分子量小于1500bp的DNA片段和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。大片段DNA分子在TBE緩沖液中無法完全分離。

6 DNA電泳常見問題分析及解決方案