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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是怎么回事?
發(fā)布時間:2021-08-13瀏覽次數(shù):1074返回列表
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。
DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,加入設(shè)計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。
但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。
發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于臨床。
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;
③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍