細(xì)胞凍存是將細(xì)胞儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中，減少細(xì)胞代謝，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。在大多數(shù)細(xì)胞系中，細(xì)胞會(huì)隨著衰老和演化不斷的積累改變，造成表型和基因型的“培養(yǎng)漂移”，在凍存過(guò)程中，適當(dāng)?shù)牟僮骱秃线m的凍存條件可以減少細(xì)胞特性的改變或丟失，起到細(xì)胞保種的作用。因而，正確且成功的凍存對(duì)于細(xì)胞的長(zhǎng)久應(yīng)用起著非常重要的作用。

  01、正確的培養(yǎng)和溫和的細(xì)胞收集

  在凍存前，細(xì)胞應(yīng)保持zui-佳的生長(zhǎng)狀態(tài)(處于對(duì)數(shù)期或指數(shù)期)，理想情況下，培養(yǎng)基應(yīng)在收獲前24hgeng換。建議對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行微生物污染物檢測(cè)，特別是支原體，確保細(xì)胞沒(méi)有任何的污染。在細(xì)胞的收集過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)操作要盡可能的溫和，避免細(xì)胞受損。

  02、適當(dāng)?shù)牡蜏乇Ｗo(hù)劑

  目前，細(xì)胞凍存zui-常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞，減少在冷凍過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害。細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。

  聚乙烯基吡咯烷酮、乙二醇、甲醇和甲基乙酰胺等都是低溫保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中zui-常見(jiàn)的是二甲基亞砜(DMSO)和甘油，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，關(guān)鍵在于對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。DMSO通常濃度為5 - 10% (v/v)，zui-佳濃度隨細(xì)胞系的不同而不同。甘油在冷凍介質(zhì)中的zui終濃度為5 - 15%，同樣，zui-佳濃度取決于細(xì)胞系。為了提高較難保存的細(xì)胞的存活率，凍存時(shí)可以選擇增加保存液中的血清濃度。想要凍存細(xì)胞geng快geng穩(wěn)，細(xì)胞凍存液會(huì)是不錯(cuò)的選擇，無(wú)需配制，直接在細(xì)胞中加入適量的凍存液即可，操作簡(jiǎn)單，就能擁有高活率的細(xì)胞。

  03、緩慢的凍存速度

  慢速凍存對(duì)細(xì)胞活力的恢復(fù)是非常重要的。對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，每分鐘降低-1到-3℃能讓細(xì)胞geng好適應(yīng)凍存狀態(tài)。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的方法是梯度降溫法：在4℃放置30 min，再轉(zhuǎn)入-20℃存放 2h，接著轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷凍過(guò)夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存。一款可重復(fù)使用的細(xì)胞凍存盒，可省去多次反復(fù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的時(shí)間，將準(zhǔn)備好的細(xì)胞凍存管放進(jìn)凍存盒，直接在-80℃過(guò)夜后就可以轉(zhuǎn)移至液氮罐中。無(wú)論使用哪種凍存方法，重要的是在轉(zhuǎn)移存放位置的過(guò)程中一定要迅速，轉(zhuǎn)移時(shí)建議將凍存管放在干冰中恒溫，盡量避免轉(zhuǎn)移過(guò)程因溫度變化對(duì)細(xì)胞活力的影響。

  04、持續(xù)的低溫儲(chǔ)存

  細(xì)胞溫度應(yīng)始終保持在-130℃以下，才能達(dá)到zui-佳存活率。如果存放溫度控制不好，存活率會(huì)隨著時(shí)間的推移而降低。建議將細(xì)胞在液氮條件下長(zhǎng)期保存，需要定期人工檢查液氮罐的密閉性和液氮量是否充足，避免因儲(chǔ)存條件造成細(xì)胞的損毀