一、熒光素酶報告基因的檢測原理

熒光素酶（Luciferase）是生物體內(nèi)催化熒光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化發(fā)光的一類酶的總稱，來自于自然界能夠發(fā)光的生物。

自然界存在的熒光素酶來自螢火蟲、發(fā)光細(xì)菌、發(fā)光海星、發(fā)光節(jié)蟲、發(fā)光魚、發(fā)光甲蟲等。細(xì)菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細(xì)胞的應(yīng)用中受到限制。目前，以北美螢火蟲蟲(Photinus pyralis)來源的熒光素酶基因應(yīng)用的zui為廣泛，該基因可編碼550個氨基酸的熒光素酶蛋白，是一個61kDa的單體酶，無需表達(dá)后修飾，直接具有完全酶活。

發(fā)光機(jī)制

生物熒光實質(zhì)是一種化學(xué)熒光。螢火蟲熒光素酶在Mg2+、ATP、O2的參與下，催化D2熒光素(D2luciferin) 氧化脫羧，產(chǎn)生激活態(tài)的氧化熒光素，并放出光子，產(chǎn)生550～580 nm 的熒光，其化學(xué)反應(yīng)式如下。

這種無需激發(fā)光就可發(fā)出偏紅色的生物熒光，其組織穿透能力明顯強(qiáng)于綠色熒光蛋白(GFP)。熒光素酶是靠酶和底物的相互反應(yīng)發(fā)光，特異性很強(qiáng)，靈敏度高，由于沒有激發(fā)光的非特異性干擾，信噪比也比較高。

二、熒光素酶報告基因的檢測流程
1、重組質(zhì)粒制備: 制備含有待檢測基因-Luc/Rluc的重組質(zhì)粒；
2、細(xì)胞系選擇: 根據(jù)實驗需要選擇細(xì)胞株，通常選擇轉(zhuǎn)染效率較高的293T細(xì)胞或原代細(xì)胞等；
3、共轉(zhuǎn)染: 將帶有Luc/Rluc標(biāo)記的報告基因和目的基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，設(shè)置不同的檢測時間點，一般為24h/48h；
4、外界干預(yù): 轉(zhuǎn)染后，可進(jìn)行物理/化學(xué)/病毒等的相應(yīng)刺激；
5、細(xì)胞處理: 采用進(jìn)口/國產(chǎn)雙熒光素酶檢測試劑盒依照protocol操作；
6、熒光檢測: 使用GENios Pro 酶標(biāo)儀或具有類似檢測功能的設(shè)備進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測。

三、熒光素酶報告基因的優(yōu)點
1、優(yōu)越的靈敏度，比Westernbloting靈敏度高1000倍以上；
2、內(nèi)源性低，哺乳動物無內(nèi)源性表達(dá)；
3、熒光素酶檢測不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響；
4、發(fā)光檢測，檢測方便；
5、靈敏度高，10‐20摩爾熒光素酶分子；
6、檢測范圍廣，大于7個數(shù)量級。

四、主要應(yīng)用領(lǐng)域
1、潛在啟動子/啟動子核心區(qū)域檢測；
2、潛在增強(qiáng)子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測；
3、啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點檢測；
4、啟動子/增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用；
5、病毒/細(xì)胞相互作用；
6、藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)（抑制或增強(qiáng)）；
7、射線等物理誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)（抑制或增強(qiáng)）。

五、熒光素酶報告基因檢測方法與Western-Blot檢測方法在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控機(jī)制研究中的區(qū)別

1、熒光素酶報告基因檢測是測定上游刺激對下游靶基因在轉(zhuǎn)錄水平的影響，即對靶基因mRNA表達(dá)水平的影響，可以通過實時熒光定量PCR來驗證；Western blot是測定上游刺激對下游靶基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)水平的影響，特別是磷酸化程度的改變。因此，兩方面的實驗結(jié)果可以結(jié)合起來geng細(xì)致、geng全面地揭示細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的分子機(jī)制。

2、熒光素酶報告基因檢測方法操作過程相對簡單，檢測靈敏度較高；Western blotting操作過程繁瑣，檢測靈敏度較低。

3、熒光素酶報告基因檢測只需要成功將含有目標(biāo)DNA序列插入到報告載體中，即可進(jìn)行后續(xù)實驗，Western blotting則需要購買商品化的一抗，一般價高量少，且抗體的雜交條件需要摸索；若自制的一抗，抗體效價需要驗證，實驗周期較長