在研究植物生命活動(dòng)過程中，常常需要準(zhǔn)確了解某一激素的含量以及各激素間的比例。因此，植物內(nèi)源激素的提取分離和測定是植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中其重要的內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)以ABA和GA為例，介紹激素的提取、分離及測定的基本原理和方法。

一、原理

利用脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有機(jī)溶劑（如丙酮、甲醇）的特性進(jìn)行提取，將粗提物經(jīng)過一系列的分離技術(shù)（如萃取、薄層層析或紙層析等），使ABA、GA與其它成分分離。再對(duì)純化的ABA和GA進(jìn)行生物學(xué)鑒定或物理化學(xué)鑒定。

（一）生物鑒定1.ABA能抑制植物器官的生長，在一定的濃度條件下，其抑制程度與濃度呈線性關(guān)系。利用這一線性關(guān)系就可確定組織中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的節(jié)間伸長，特別是矮生植物的莖。在一定濃度范圍內(nèi)，莖的伸長度與GA濃度呈線性關(guān)系。因此，根據(jù)莖的伸長度就可確定GA的含量。

（二）物理化學(xué)鑒定：可采用氣相色譜法。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

（一）材料：植物葉片、水稻種子及幼苗等；

（二）儀器設(shè)備：1.氣相色譜儀；2.分液漏斗；3.組織勻漿器；4.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥器；5.層析缸；6.華特曼-3號(hào)層析紙；7.微量注射器。

（三）試劑：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油醚；4. 乙酸乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯-仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁醇；12. 異丙醇；13. 3mol/L氨水。

三、實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果計(jì)算

（一）脫落酸和赤霉素的提取和分離

1.樣品提?。?）取新鮮材料或貯存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待測時(shí)）10g，剪碎，加入60ml預(yù)冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，勻漿5min，勻漿液在4℃下振蕩（或攪拌）24h，過濾。殘?jiān)儆?0ml甲醇液振蕩1h。反復(fù)二次，濾液混合。（2）將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥減壓蒸發(fā)（36～38℃）至原體積一半，再加入10ml石油醚提取部分色素，將下層甲醇液取出，棄掉石油醚層，繼續(xù)減質(zhì)濃縮至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。

2.樣品萃取將水溶液用1mol/LHCl調(diào)pH至2.8～2.5左右。并以與水溶液等體積的乙酸乙酯萃取。將混合溶液裝入分液漏斗，分離水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙酯溶液。此時(shí)，CTK（細(xì)胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸乙酯中。

3.樣品的純化（1）將乙酸乙酯溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干。用2ml100％甲醇溶解殘留物。（2）點(diǎn)樣：取100μl甲醇溶液點(diǎn)在涂有硅膠GF254玻板下端1cm處（或點(diǎn)在華特曼3號(hào)層析紙上），并在同一水平上分別點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)GA和ABA溶液100μl。（3）展層：用異丙醇-28％氨水-水（10∶1∶1，V／V／V）作為展層劑展層。前沿至玻板頂端0.5cm處即停止展層。（4）定位：層析完畢后，吹干玻板并在紫外燈下觀察色帶，與標(biāo)準(zhǔn)ABA和GARf值相同或相近的色帶，就作為純化后的ABA和GA。（5）洗脫：將ABA和GA帶分別括下（或剪下），用95％乙醇浸提3次。溶液經(jīng)減壓蒸干后，即可進(jìn)一步作生物學(xué)測定或氣相色譜測定之用。

（二）ABA和GA的測定

1.ABA的生物學(xué)鑒定

（1）材料培養(yǎng)：精選小麥種子，25℃黑暗下浸種2h，排于培養(yǎng)皿濕濾紙上，在25℃下發(fā)芽。待胚根出現(xiàn)后，移入培養(yǎng)缸中的塑料網(wǎng)上，繼續(xù)在25℃暗中培養(yǎng)。約72h后，選取胚芽鞘2.8～3.0cm的幼苗，用刀片自頂端分別切成3mm，5mm，5mm三小段，取中間5mm切段置蒸餾水中2～3h，備用。

（2）ABA母液（200μg/ml）的配制：稱取20mgABA，溶于少量酒精，以無離子水定容至100ml。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：吸取5ml母液，加無離子水定容至100ml，即為10μg/ml。吸取5ml10μg/mlABA溶液，用2％蔗糖-0.01mol/L磷酸緩沖液（pH5.0）定容至50ml，即為1μg/mlABA標(biāo)準(zhǔn)液。余此類推，分別配成0、0.001、0.01、0.1、1μg/ml標(biāo)準(zhǔn)液。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取2ml各種濃度的ABA標(biāo)準(zhǔn)液分別置入10ml具塞試管，每管加入小麥芽鞘切段10根。各濃度均需3～4個(gè)重復(fù)。加塞后，置暗處25℃搖床上振蕩20h。將10個(gè)切段取出測定其總長度（cm），然后按下列公式計(jì)算處理后減少的百分?jǐn)?shù)（R）：R（％）＝(D空-D處理)/D原×100。

式中：D空：空白總長度；D處理：處理總長度；D原：原始總長度（5.0cm）。用R與ABA濃度的相關(guān)性，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）將待測樣品溶于2ml2％蔗糖-0.01mol/L磷酸緩沖液（pH5.0），置具塞試中，按上述步驟操作，算出R值，再查標(biāo)準(zhǔn)曲線，就得到ABA濃度C，依下式計(jì)算出樣品中ABA含量：ABA含量（μg/g鮮重）＝C（μg/ml×2×10-1/W（g）2.ABA的氣相色譜測定將洗脫的ABA加入0.1mlBSA（N.O-二-三甲基硅烷基乙酰胺）使脫落酸硅烷化。0.5h后，吸取5μl作氣相層析，層析條件：柱長2m，φ5mm（不銹鋼柱）、固定相為10％SE-30，DMCS、A、W為擔(dān)體，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫200℃，F(xiàn)ID檢測。載氣流速為30μl/min，采用內(nèi)標(biāo)法定性，外標(biāo)法定量。計(jì)算：ABA含量（μg/g鮮重）＝A1×Ws×100×1/(As×5×W)