無 Ct 值出現(xiàn)

檢測熒光信號的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時采集，Taqman 法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。

引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測其完整性。

模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的zui高濃度做起。

模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct >38）

擴增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針，改用三步法進行反應(yīng)。適當降低退火溫度，增加鎂離子濃度等。

PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

PCR 產(chǎn)物太長： 一般采用 80-150 bp 的產(chǎn)物長度。

Ct 值比較靠后

Ct 值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經(jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量 PCR 的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此zui好能夠把 Ct 值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。

標準曲線的 slope 總大于４，每個梯度的平行 Ct 值差別大

這個斜率是＝1/LOG 10（擴增效率），理論上擴增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大于 4，說明擴增效率比較小?？梢钥疾橐幌路磻?yīng)體系是否合理，酶活是否正常，試劑盒的質(zhì)量是否有保證。只有在引物和模板處于zui適比例時才能得到比較滿意的擴增效率，因此通過調(diào)節(jié) PCR 反應(yīng)體系中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。

平行管的 Ct 值差別大可以考查一下自己實驗操作是否規(guī)范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會導致 Ct 值差別比較大。

ROX 染料是什么作用？

ROX 的作用 ABI 宣稱是用來校準加樣誤差的。但是據(jù)說 ROX 的作用實際上是用來校準光程差的。即每個孔的熒光信號經(jīng)過濾光片在經(jīng)過聚焦到 CCD 的時候，走過的光程是不一樣的，這樣在 CCD 上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個差異用 ROX 來計算孔間差異有多大，然后差異系數(shù)去處理，實際的熒光信號。

如何確定熒光定量 PCR 的基線

基線就是背景值，因此就是曲線在沒有「起跳」之前的一段。在軟件上有一個地方可以輸入 baseline 從第幾到第幾 cycle 作為基線。設(shè)置原則是使沒有起跳之前zui多的 cycle 的信號接近 0。

引物和探針對 Ct 值有什么影響

先要保證引物能夠跟模板完全配對，第二，引物應(yīng)該是過量的。第三，引物不應(yīng)該形成引物二聚體。也說白了就是要保證體系的擴增效率盡量地達到2并且沒有非特異性擴增。在保證這個前提之下引物對 Ct 值是沒有影響的。

如果一和第二沒有達到，應(yīng)該 Ct 值會變大。如果第三沒有達到那么 Ct 值應(yīng)該變小。探針應(yīng)該與模板完全配對，并且有一定的長度，濃度過量。保證探針能夠特異性地完全結(jié)合在模板上。