北京百奧萊博供應(yīng)的T4 DNA連接酶用于科研目的，我公司的T4 DNA連接酶品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括T4 DNA連接酶在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：T4 DNA連接酶
英文名稱：T4 DNA Ligase
產(chǎn)品貨號(hào)：YT029
產(chǎn)品規(guī)格：40000U|200000U

本酶可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5"-P末端和3"-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為輔助因子。同時(shí)T4 DNA 連接酶可以修補(bǔ)雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺刻(single-strand nicks)。

用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和載體、linker或adaptor等的連接。也可以用于缺刻修復(fù)及Ligase介導(dǎo)的RNA檢測。
來源：本T4 DNA Ligase由大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因的來源為T4嗜菌體。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of
lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5"-DNA termini concentration of 0.12 μM (300 μg/ml)。200U等于1個(gè)Weiss unit，以Weiss unit計(jì)，本產(chǎn)品共200單位。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)連接反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50% (v/v) glycerol。
10×Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP。
失活或抑制：65℃孵育10分鐘可以導(dǎo)致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl濃度大于200mM時(shí)強(qiáng)烈抑制T4 DNA Ligase。


T4 DNA Ligase連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)后涂板LB平板的效果如上圖，本品的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后涂板獲得的LB平板效果圖。A. 雙酶切后的載體自連過夜；B. 雙酶切后的載體與待插入片段過夜連接。

注意事項(xiàng)：
1. 對(duì)于普通的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的操作，不必對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化。但用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通常宜先用DNA純化試劑盒或酚lǜ仿抽提方法等純化DNA，然后再進(jìn)行電轉(zhuǎn)。
2. 需進(jìn)行平端連接或快速連接時(shí)，推薦使用百奧萊博的快速DNA連接試劑盒(YT028/D7003)。T4 DNA Ligase可以進(jìn)行平端連接，但效率較低。
3. 普通連接反應(yīng)不必進(jìn)行凝膠電泳觀察。如果需要對(duì)于連接產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳觀察，推薦先在65℃孵育10分鐘使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA結(jié)合導(dǎo)致的條帶位置遷移(band shift)。

儲(chǔ)存條件：-20℃。

根據(jù)您的關(guān)注的T4 DNA連接酶，您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求：



名稱：AURKA/10 mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0109
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.AURKA/10 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時(shí)。某些組織對(duì)過度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
AURKA/10的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
ZN0122	Bcl-2 mRNA原位雜交試劑盒	100T
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ZN0434	EAAT2,IsoformB mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0438	ECP mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0490	FADD mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0561	GALR1 mRNA原位雜交試劑盒	100T

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