adapter快速連接試劑（il是高品質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，adapter快速連接試劑（il是我司眾多優(yōu)質(zhì)基因結(jié)構(gòu)和功能之一，質(zhì)量堪比同類(lèi)進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷(xiāo)中，恭候您的咨詢(xún)訂購(gòu)。...

特別提示：包括adapter快速連接試劑（illumina)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱(chēng)：adapter快速連接試劑（illumina)
英文名稱(chēng)：Fast Ligation Reagent
產(chǎn)品貨號(hào)：WH0201
產(chǎn)品規(guī)格：24次|96次

本制品是專(zhuān)門(mén)針對(duì)于illumina高通量測(cè)序平臺(tái)所優(yōu)化的預(yù)混酶模塊。使用本模塊可以將3"端帶有dA尾的DNA片段與adapter進(jìn)行快速連接。與常規(guī)方法比較，本模塊采用了一步法反應(yīng)流程，BaiSeq Fragmentation/DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑或BaiSeq DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑反應(yīng)后所獲得的片段后DNA，無(wú)需磁珠純化，可使用本模塊直接與adapter進(jìn)行連接，省去了多步磁珠純化步驟，操作更加簡(jiǎn)便，文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率更高。適用樣本量：0.25ng～1μg DNA。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
·無(wú)需磁珠純化，可直接將DNA adapter與帶有dA-Tailing的DNA片段連接。
·連接，可進(jìn)行微量樣本的DNA adapter連接。

適用范圍：
將DNA adapter與3"端添加dA的DNA文庫(kù)片段的快速連接（如Fragmentation/DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑或DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑處理后的產(chǎn)物）

試劑盒組成：

組分	24次	96次
DNA Ligase	240μl	960μl
5×Ligation Buffer	500μl	2×1ml
Nuclease-Free ddH2O	1ml	2×1ml

保存條件：-25～-15℃保存，避免反復(fù)凍融，保質(zhì)期為一年。

注意事項(xiàng)（請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)）
1．操作過(guò)程請(qǐng)注意避免核酸樣品和產(chǎn)物之間的交叉污染。
2．請(qǐng)使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進(jìn)行試驗(yàn)。
3．試驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)清潔操作臺(tái)，并使用RNA酶及DNA清除試劑處理臺(tái)面，確保沒(méi)有RNA酶和DNA的污染。
4．進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增前，請(qǐng)確保PCR儀已經(jīng)調(diào)試好并處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
5．試驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，如果需要暫停試驗(yàn)，或者無(wú)需立即進(jìn)行下游試驗(yàn)?？筛鶕?jù)說(shuō)明書(shū)推薦將試驗(yàn)產(chǎn)物保存于-20℃并安排后續(xù)試驗(yàn)。

操作步驟：

1．DNA片段經(jīng)Fragmentation/DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑或DNA末端修復(fù)/加dA尾試劑處理，完成A尾添加反應(yīng)后，向此50μl反應(yīng)體系中加入Y μl的adapter溶液，輕柔吸打混勻后置冰上。
  注意：本試劑盒中不含測(cè)序DNA adapter，推薦配合Single-Indexed Adapter（Illumina? Platforms) （WH0206)使用，為了達(dá)到較高的連接效率，我們推薦反應(yīng)體系中DNA片段與adapter的摩爾比在10:1至200:1之間，詳見(jiàn)WH0206產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
2．按照下表所示各組分用量配制反應(yīng)體系，并將配制完成的反應(yīng)體系輕柔混勻后置于冰上。

成分	使用量
5×Ligase Buffer	20μl
DNA Ligase	10μl
Nuclease-Free ddH2O	（20-Y)μl

  注：對(duì)于多個(gè)樣品，請(qǐng)計(jì)算所需試劑的總體積并在此基礎(chǔ)上額外添加10%的試劑，以避免分裝過(guò)程中槍頭掛壁損失而導(dǎo)致試劑體積不足。
3．將此配制好的（50-Y）μl連接反應(yīng)液加入至第1步準(zhǔn)備的反應(yīng)液中，輕柔吸打混勻，置于20℃中反應(yīng)15min。
  注意：此步驟如果使用PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，請(qǐng)不要啟動(dòng)熱蓋。
4．向反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.8×體積（80 μl）Agencourt AMPure XP磁珠進(jìn)行純化，具體步驟如下：
①將AMPure@XP磁珠置于室溫平衡20 min。
②渦旋使磁珠充分懸浮，加入80 μl Agencourt AMPure XP磁珠至步驟3溶液中，充分吸打混勻。
③室溫孵育5 min，將反應(yīng)管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全貼壁后，用移液器吸棄上清。
④向反應(yīng)管內(nèi)加入200 μl 80%乙醇，輕輕震蕩混勻，洗滌磁珠，并用磁力架回收磁珠，棄上清。
⑤將含有磁珠的反應(yīng)管置磁力架上，開(kāi)蓋室溫放置5~10 min，至晾干。
  注：不要過(guò)分干燥磁珠，否則會(huì)造成得率降低。
⑥加入25 μl 10mM Tris-HCl （pH 8.0)至離心管內(nèi)并使用移液器輕輕吸打磁珠至充分懸浮。將反應(yīng)管放置于磁力架上1~2 min，只使磁珠完全貼壁后，轉(zhuǎn)移約20 μl上清至新的離心管中，用于后續(xù)的PCR富集實(shí)驗(yàn)。
  注：如果需要對(duì)DNA片段大小進(jìn)行選擇，則請(qǐng)參照DirectFast DNA Library Kit （illumina) （WH0203)說(shuō)明書(shū)中片段分選步驟進(jìn)行操作。如果連接產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行PCR富集，可在步驟g)中加入12.5 μl的10mM Tris-HCl （pH 8.0)洗脫DNA，并轉(zhuǎn)移10 μl純化后的DNA用于后續(xù)的試驗(yàn)反應(yīng)。如不立即使用，請(qǐng)將樣品凍存于-20℃保存。

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名稱(chēng)：Androgenbinding protein/ABP mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0057
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.Androgenbinding protein/ABP mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過(guò)氧化物酶 5ml。
用戶(hù)自備試劑：
原位雜交專(zhuān)用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過(guò)度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴(lài)氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專(zhuān)用蓋玻片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過(guò)夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過(guò)氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話(huà)，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過(guò)4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過(guò)2小時(shí)。某些組織對(duì)過(guò)度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過(guò)1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴(lài)氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶(hù)可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀(guān)察：
Androgenbinding的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過(guò)不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋?zhuān)话阆♂?—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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