WH0208 DNA片段化/末端修復(fù)/加dA尾

北京百奧萊博供應(yīng)的DNA片段化/末端修復(fù)/加dA尾用于科研試驗(yàn),本產(chǎn)品質(zhì)量好,且具價(jià)格,深為用戶稱道,了解更多DNA片段化/末端修復(fù)/加dA尾等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品請(qǐng)聯(lián)系我司咨詢訂購(gòu)。...
特別提示:包括DNA片段化/末端修復(fù)/加dA尾試劑(Illumina)在內(nèi),本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱:DNA片段化/末端修復(fù)/加dA尾試劑(Illumina)
英文名稱:Fragmentation/End repair/dA-tailing Reagent(Illumina)
產(chǎn)品貨號(hào):WH0208
產(chǎn)品規(guī)格:24次|96次
本制品是專門(mén)針對(duì)于illumina高通量測(cè)序平臺(tái)所優(yōu)化的預(yù)混酶模塊,包含了DNA片段化、末端修復(fù)以及3"端dA尾添加所需的所有酶類(lèi),可將雙鏈DNA片段化為小片段,并分別在片段化DNA兩端添加5"-P和3"端dA,所得產(chǎn)物無(wú)需純化,可直接通過(guò)Fast Ligation Reagent(WH0201-01/02)用于adapter的連接。該模塊采用一步法的反應(yīng)流程,省去了多步純化步驟,可對(duì)微量DNA樣本進(jìn)行、快速的片段化、末端修復(fù)及dA尾添加,操作更加簡(jiǎn)便,文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率更高。
適用范圍:用于雙鏈DNA的片段化、末端修復(fù)及3"端添加dA,適用于illumina高通量測(cè)序平臺(tái)DNA文庫(kù)構(gòu)建。
適用樣本量:1ng~1μg DNA。
產(chǎn)品特點(diǎn):
·單管酶促反應(yīng),一步完成雙鏈DNA的片段化、末端修復(fù)、dA添加反應(yīng)。
·高文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率,DNA樣本起始量可低至1ng。
產(chǎn)品組成:
組分 | 24次 | 96次 |
5×FEA Enzyme Mix | 240μl | 960 μl |
10×FEA Reaction Buffer | 120 μl | 480 μl |
FEA Enhance | 120 μl | 480 μl |
Nuclease-Free ddH2O | 1ml | 4×1ml |
保存條件:-25~-15℃保存,避免反復(fù)凍融,保質(zhì)期為一年。
注意事項(xiàng):(請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng))
1.操作過(guò)程請(qǐng)注意避免核酸樣品和產(chǎn)物之間的交叉污染。
2.請(qǐng)使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進(jìn)行試驗(yàn)。
3.試驗(yàn)開(kāi)始前,請(qǐng)清潔操作臺(tái),并使用RNA酶及DNA酶清除試劑,如RNase Away處理臺(tái)面。確保沒(méi)有RNA酶和DNA的污染。
4.進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增前,請(qǐng)確保PCR儀已經(jīng)調(diào)試好并處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
5.試驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū),如果需要暫停試驗(yàn),或者無(wú)需立即進(jìn)行下游試驗(yàn)??筛鶕?jù)說(shuō)明書(shū)推薦將試驗(yàn)產(chǎn)物保存于-20℃并安排后續(xù)試驗(yàn)。
6.由于使用本品所進(jìn)行的片段化過(guò)程為酶促反應(yīng),故片段化過(guò)程對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、體系配制以及DNA上樣量等因素較為敏感。強(qiáng)烈推薦用戶按照本說(shuō)明書(shū)所述步驟及優(yōu)化的反應(yīng)參數(shù)(如反應(yīng)時(shí)間等)進(jìn)行試驗(yàn)。
推薦使用的其他試劑:
1.Fast Ligation Reagent(WH0201-01/02)
2.NGS Library Amplification Reagent(WH0210-01/02)
3.Single-Index Adapter(Illumina)(WH0206-01/02/03)
4.BECKMAN Agencourt AMPure XP磁珠
操作步驟:
一、試驗(yàn)準(zhǔn)備
1.在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前,明確核酸的濃度及純度至關(guān)重要,推薦上樣量1ng~1μg DNA。DNA需溶解于以下溶液中:去離子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE(0.1×TE)等。
注意:
?確定上樣DNA濃度至關(guān)重要,尤其在上樣量低于100 ng時(shí)。推薦使用Qubit、Picogreen或者其他染料法對(duì)DNA濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
?請(qǐng)確認(rèn)DNA溶液中不含陽(yáng)離子及螯合劑。如果DNA溶解于1×TE或不確定DNA溶液中的EDTA濃度,請(qǐng)參照附錄Ⅰ所述步驟,使用BECKMAN公司的Agencourt AMPure XP磁珠進(jìn)行純化或參照附錄Ⅲ進(jìn)行片段化處理。
2.將各試劑置于冰上,5×FEA Enzyme Mix融化后用手指后輕彈混勻,不要渦旋。其余試劑可短暫渦旋混勻。
二、試驗(yàn)步驟
1.照下表設(shè)置PCR儀反應(yīng)程序。開(kāi)啟熱蓋,熱蓋溫度設(shè)置為70℃。
操作步驟 | 溫度 | 時(shí)間 |
1 | 4℃ | 1min |
2 | 32℃ | 3-24min* |
3 | 65℃ | 30min |
4 | 4℃ | 保持 |
*注:確切的片段化反應(yīng)時(shí)間需要根據(jù)DNA的實(shí)際上樣量進(jìn)行優(yōu)化。下表1中列出10ng、100ng和1000ng上樣量DNA片段化所需的時(shí)間,用戶可以依據(jù)此時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。調(diào)整過(guò)程中,我們推薦額外設(shè)置一個(gè)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)3min以及一個(gè)縮短3min的對(duì)照。這樣有助于確定切割至所需片段大小時(shí)所需要的準(zhǔn)確反應(yīng)時(shí)間。關(guān)于片段化時(shí)長(zhǎng)的更多建議,請(qǐng)參考附錄II。
表1:片段化時(shí)間選擇表(32℃)
DNA主峰大小 | 250bp | 350bp | 450bp | 550bp |
10ng DNA上樣量 | 24min | 16min | 14min | 10min |
100ng DNA上樣量 | 16min | 10min | 8min | 6min |
1000ng DNA上樣量 | 14min | 8min | 6min | 4min |
2.請(qǐng)按下表配制反應(yīng)體系,冰上操作,各組分加入后,請(qǐng)輕柔吸打混勻,注意不要渦旋。
當(dāng)DNA上樣量>10 ng
成分 | 用量 |
10×FEA Reaction Buffer | 5 μl |
DNA樣本 | X μl |
Nuclease-Free ddH2O | (35-X) μl |
總體積 | 40 μl |
當(dāng)DNA上樣量≤10 ng
成分 | 用量 |
10×FEA Reaction Buffer | 5 μl |
DNA樣本 | X μl |
FEA Enhancer | 2.5 μl |
Nuclease-Free ddH2O | (32.5-X) μl |
總體積 | 40 μl |
注:對(duì)于多個(gè)反應(yīng),請(qǐng)計(jì)算所需試劑的總體系并在此基礎(chǔ)上增加體系10%,以避免因溶液轉(zhuǎn)移過(guò)程中掛壁損失而造成分裝反應(yīng)數(shù)不足的問(wèn)題。
3.取1個(gè)新的200 μl薄壁管置冰上,向管中加入10 μl 5×FEA enzyme Mix,隨后將(2)中反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移40 μl至同一薄壁管中,輕柔吸打混勻6-8次。
4.瞬時(shí)離心薄壁管,立刻置于已預(yù)冷至4℃的PCR儀中,并啟動(dòng)反應(yīng)程序。
5.當(dāng)反應(yīng)程序結(jié)束后,將薄壁管從PCR儀中取出并置冰上。
6.立即進(jìn)入接頭連接步驟,為保證連接效率,推薦使用Fast Ligation Reagent(WH0201-01/02)。
附錄I:DNA樣品溶液中二價(jià)鹽離子以及EDTA的去除
請(qǐng)參照供應(yīng)商提供的步驟進(jìn)行純化。
1.若DNA溶液體積小于50 μl,請(qǐng)用無(wú)核酸酶的去離子水補(bǔ)足體積至50 μl。
2.加入90 μl(1.8倍體積)完全渦旋混勻的Agencourt AMPure XP磁珠至DNA溶液中,吸打混勻。若DNA溶液體積大于50 μl,請(qǐng)根據(jù)DNA溶液的實(shí)際體積,加入1.8倍體積完全渦旋混勻的Agencourt AMPure XP磁珠。
3.室溫孵育5 min后,將反應(yīng)管置于磁力架上2~4 min收集磁珠,小心去除上清液。
4.用200 μl 80%乙醇洗滌磁珠,將反應(yīng)管置于磁力架上收集磁珠,棄去上清。重復(fù)此洗滌步驟一次。
5.將反應(yīng)管置于磁力架上,打開(kāi)離心管蓋于室溫條件下晾置10 min或至磁珠干燥為止。
6.加入45 μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)使磁珠完全懸浮后,置磁力架上2 min。待磁珠貼壁后小心轉(zhuǎn)移42.5 μl上清至新的離心管。
7.使用Quibit、Picogreen或其他熒光定量方法測(cè)定純化后的DNA濃度。
附錄II:優(yōu)化片段化處理時(shí)間
片段化反應(yīng)時(shí)間需要根據(jù)DNA上樣量進(jìn)行優(yōu)化,參考圖1所示曲線選擇反應(yīng)時(shí)間。優(yōu)化過(guò)程請(qǐng)使用將實(shí)際用于測(cè)序的DNA樣品,這將有助于在測(cè)序時(shí)保證片段化過(guò)程的可重復(fù)性。初次優(yōu)化時(shí),我們推薦添加2個(gè)額外的反應(yīng)時(shí)間,即依據(jù)圖中曲線選擇反應(yīng)時(shí)間后,在此時(shí)間基礎(chǔ)上分別延長(zhǎng)和縮短3min。若對(duì)片段大小有較的要求,可在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行微調(diào)。在實(shí)際操作中,若DNA上樣量≥10 ng,用戶可在片段化步驟完成后即對(duì)反應(yīng)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體方法為使用1.8倍體積AMPure@XP磁珠對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化,并將其溶解于10 μl Tris溶液或去離子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity試劑盒確定片段分布。
對(duì)于上樣量<10 ng的片段化反應(yīng),為了節(jié)省反應(yīng)時(shí)間,我們推薦在每個(gè)反應(yīng)體系中(50 μl)添加2.5 μl的FEA Enhancer。反應(yīng)時(shí)間則推薦使用圖1中將10 ng DNA切割至特定片段大小所需時(shí)間的一半。例如:若期望DNA片段集中于350 bp,則加入FEA Enhancer后反應(yīng)10 min左右即可。

圖1不同DNA上樣量經(jīng)片段化后產(chǎn)出片段大小與反應(yīng)時(shí)間對(duì)應(yīng)曲線
附錄III:1×TE溶液中DNA的片段化/末端修復(fù)/A尾添加
當(dāng)DNA溶解于1×TE溶液中時(shí),請(qǐng)參照以下步驟進(jìn)行DNA的片段化/末端修復(fù)/A尾添加反應(yīng)。
1.按照下表設(shè)置PCR儀反應(yīng)程序。請(qǐng)確認(rèn)在反應(yīng)中開(kāi)啟熱蓋。如有可能,請(qǐng)將熱蓋溫度設(shè)置為70℃。DNA上樣量為1-1000ng。
反應(yīng)步驟 | 反應(yīng)溫度 | 反應(yīng)時(shí)間 |
1 | 4℃ | 1min |
2 | 32℃ | 5-35min* |
3 | 65℃ | 30min |
4 | 4℃ | 保持 |
*注:反應(yīng)時(shí)間需根據(jù)DNA的實(shí)際上樣量進(jìn)行優(yōu)化。若DNA上樣量≥10 ng,反應(yīng)體系中加入2.5 μl FEA Enhancer,推薦使用25 min作為起始反應(yīng)時(shí)間,此時(shí)產(chǎn)生的片段主要集中于300-500 bp;若DNA上樣量<10 ng,反應(yīng)體系中加入5 μl FEA Enhancer,則推薦使用15 min作為起始時(shí)間,此時(shí)片段集中于300 bp。若需要進(jìn)行調(diào)整,則請(qǐng)以3min為單位,在原反應(yīng)時(shí)間基礎(chǔ)上進(jìn)行增減,直至得到所需要的片段大小。
2.為了保證良好的試驗(yàn)效果,請(qǐng)嚴(yán)格按照以下說(shuō)明進(jìn)行操作。在一個(gè)新的薄壁管中參照下表配制反應(yīng)體系,此步請(qǐng)于冰上操作,配置好的反應(yīng)體系經(jīng)輕柔吸打混勻,注意不要渦旋震蕩。
當(dāng)DNA上樣量≥10ng
成分 | 用量 |
10×FEA Reaction Buffer | 5μl |
DNA樣本 | X μl |
FEA Enhancer | 2.5μl |
Nuclease-Free ddH2O | (32.5-X) μl |
總體積 | 40μl |
當(dāng)DNA上樣量<10ng
成分 | 用量 |
10×FEA Reaction Buffer | 5μl |
DNA溶液 | X μl |
FEA Enhancer | 5μl |
Nuclease-Free ddH2O | (30-X) μl |
總體積 | 40μl |
1.取新的PCR薄壁管置冰上,加入10 μl 5×FEA Enzyme Mix。隨后將上一步準(zhǔn)備好的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移40 μl至同一薄壁管中。輕柔吸打混勻6-8次。注意操作過(guò)程中請(qǐng)保持反應(yīng)管置于冰上。
2.將薄壁管瞬時(shí)離心后,立刻轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷至4℃的PCR儀中,并啟動(dòng)反應(yīng)程序。
3.當(dāng)反應(yīng)程序結(jié)束,PCR儀溫度降至4℃后,將薄壁管從PCR儀中取出并置冰上。立即進(jìn)入接頭連接步驟,為保證連接效率,推薦使用Fast Ligation Reagent(WH0209-01/02)。
根據(jù)您的關(guān)注的DNA片段化/末端修復(fù)/加dA尾試劑(Illumina),您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求:
名稱:基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?br /> 貨號(hào):YT027
規(guī)格:10次
本試劑盒可以用于點(diǎn)突變,多個(gè)鄰近密碼子的突變,單個(gè)或多個(gè)鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)。
本試劑盒是一個(gè)利用目前zuì新的基因點(diǎn)突變技術(shù)設(shè)計(jì)而成的試劑盒。只需通過(guò)基于PCR的突變質(zhì)粒的合成,和基于Dpn I的模板質(zhì)粒的消化,轉(zhuǎn)化培養(yǎng)以及后續(xù)的酶切或測(cè)序鑒定,即可得到預(yù)期的突變質(zhì)粒(參考圖1)。累計(jì)操作時(shí)間不足2小時(shí)即可完成基因的定點(diǎn)突變。

參考上圖,使用本試劑盒時(shí)需要先設(shè)計(jì)長(zhǎng)度通常為30個(gè)堿基以上的互補(bǔ)的兩個(gè)引物,在引物中含有預(yù)期的突變位點(diǎn)。然后以待突變的質(zhì)粒為模板,用這兩個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。這樣可以產(chǎn)生含有預(yù)期的突變位點(diǎn)的雙鏈質(zhì)粒,但這個(gè)雙鏈質(zhì)粒中有兩個(gè)nick位點(diǎn)。待突變的質(zhì)粒通常來(lái)源于大腸桿菌等細(xì)菌,在細(xì)菌中會(huì)被甲基化修飾,而在體外通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的質(zhì)粒不會(huì)被甲基化。這樣用甲基化酶Dpn I處理,可以消化掉待突變的質(zhì)粒模板,而使通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)的含有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒被選擇性地保留下來(lái)。這樣把Dpn I處理過(guò)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后,質(zhì)粒中有兩個(gè)nick位點(diǎn)可以被大腸桿菌修復(fù),得到的克隆就會(huì)含有預(yù)期的突變質(zhì)粒了。
本試劑盒提供了DH5α甘油菌,可用于感受態(tài)細(xì)菌的制備。
試劑盒組份:
Pfu DNA Polymerase | 10μl |
Reaction Buffer(10X) | 100μl |
dNTP Mix(2.5mM each) | 50μl |
Dpn I | 10μl |
DH5α 甘油菌 | 200μl |
Nuclease-Free Water | 1ml |
儲(chǔ)存條件:-20℃,有效期一年。
使用說(shuō)明:
1. 引物設(shè)計(jì):
用于特定基因突變的引物需要單獨(dú)設(shè)計(jì),請(qǐng)參考如下一些基本原則進(jìn)行設(shè)計(jì):
(1) 共需設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的引物。可以先集中設(shè)計(jì)一條,然后就可以得到互補(bǔ)的另一條引物。
(2) 引物的長(zhǎng)度通常為25-45個(gè)堿基。
(3) 引物中突變位點(diǎn)任何一側(cè)都必需滿足 4X(GC堿基數(shù))+2X(AT堿基數(shù)) ≥45。但引物也不宜過(guò)長(zhǎng),否則通常會(huì)形成非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通常把突變位點(diǎn)兩側(cè)的堿基數(shù)控制在15個(gè)左右,且使兩側(cè)按照上述計(jì)算得到的數(shù)值相近。
例如引物為agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag,其中藍(lán)色的aag為突變位點(diǎn),則
左側(cè):4X(GC堿基數(shù))+2X(AT堿基數(shù))=4X8+2X7=46≥45
右側(cè):4X(GC堿基數(shù))+2X(AT堿基數(shù))=4X8+2X8=48≥45
(4) 在可能的情況下,盡量把引物的GC含量控制在40%-60%。
(5) 在可能的情況下,盡量使引物不要產(chǎn)生非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體。二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體可以通過(guò)一些軟件進(jìn)行分析。
(6) zuì好使用經(jīng)過(guò)PAGE純化的引物或更高純度的引物。
2. 引物的配制:
如果合成得到的一個(gè)引物A的量是20nmol,另外一個(gè)互補(bǔ)引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水,配制成濃度為100μM,在引物B中加入190微升水也配制成濃度為100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的離心管中,再加入160微升水,混勻后即可得到可以直接用于基因定點(diǎn)突變反應(yīng)的引物(10μM each)。
3. 待突變模板質(zhì)粒的選擇:
選擇GC含量在40-55%的待突變模板質(zhì)粒,并且每一個(gè)50bp左右的局部GC含量zuì好也不超過(guò)70%。如果GC含量過(guò)高,請(qǐng)先把目的基因克隆到其它合適的載體上,再進(jìn)行基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。另外目的基因GC含量zuì好也在40-55%的范圍,并且每一個(gè)50bp左右的局部GC含量zuì好也不超過(guò)70%。如果目的基因GC含量過(guò)高,而突變位點(diǎn)不在高GC含量區(qū)域,可以先把該基因的不含高GC含量的一個(gè)區(qū)域克隆出來(lái),進(jìn)行定點(diǎn)突變,然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質(zhì)粒模板,或者有局部高GC含量的質(zhì)粒模板,請(qǐng)另外使用專門(mén)用于高GC含量模板的PCR反應(yīng)試劑。
必需使用從dam+的大腸桿菌(這類(lèi)菌中質(zhì)粒可以被甲基化)中抽提得到的質(zhì)粒用于基因定點(diǎn)突變。常用的大部分大腸桿菌都是dam+的,包括DH5α、JM109等。
4. 基因定點(diǎn)突變反應(yīng):
(1) 如下設(shè)置基因定點(diǎn)突變反應(yīng)體系:
Nuclease-Free Water———>?μl
Reaction Buffer (10X)——>5μl
引物 (10μM each)————>2μl
dNTP Mix (2.5mM each)——>4μl
待突變模板質(zhì)粒(0.5μg)——>?μl
總體積——————————>49μl
按照上面的順序依次加入各種試劑。在上述反應(yīng)體系中,根據(jù)待突變模板質(zhì)粒的量,計(jì)算出需加入的Nuclease-Free Water的量,使總體積為49微升。適當(dāng)混勻后,加入 1 ul Pfu DNA Polymerase,混勻。如果用的PCR儀沒(méi)有熱蓋,在反應(yīng)體系上加入一滴礦物油(mineral oil)以防止蒸發(fā)。
(2) 按照如下參數(shù)設(shè)置PCR儀:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 說(shuō)明 |
1 | 1 | 95℃ | 1分鐘 | zuì初變性 |
2 | 18 | 95℃ | 40秒 | 變性 |
60℃ | 1分鐘 | 退火 | ||
68℃ | 1分鐘/kb | 延伸 | ||
3 | 1 | 72℃ | 10分鐘 | 延伸、補(bǔ)全 |
4 | 1 | 4℃ | 長(zhǎng)時(shí)間保持 | 暫時(shí)存放 |
說(shuō)明:上面表格中1分鐘/kb表示,如果待突變的質(zhì)粒為6kb,那么68℃的延伸時(shí)間為6分鐘。
5. Dpn I消化:
PCR反應(yīng)后,直接在PCR反應(yīng)體系中加入1微升Dpn I,混勻后37℃孵育1小時(shí)。37℃孵育可以在PCR儀上進(jìn)行,也可以在水浴鍋中進(jìn)行。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉(zhuǎn)化,或者-20℃保存?zhèn)溆谩?br />
6. 轉(zhuǎn)化、挑克隆鑒定:
感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率必需至少在107以上,否則很難得到克隆。根據(jù)所使用的感受態(tài)細(xì)菌,加入盡量多的經(jīng)過(guò)Dpn I消化后的突變產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。通常每100微升感受態(tài)細(xì)菌中可以加入5-10微升經(jīng)過(guò)Dpn I消化后的突變產(chǎn)物。按照所使用的感受態(tài)細(xì)菌的操作方法進(jìn)行操作,在涂板前通過(guò)離心濃縮的辦法,把所有被轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌,全部涂布到含有適當(dāng)抗生素的平板上,培養(yǎng)過(guò)夜。通常會(huì)得到50個(gè)以下的克隆。如果發(fā)現(xiàn)克隆有上千個(gè),那么肯定是有什么地方出了問(wèn)題。
對(duì)于得到的克隆,可以先挑克隆小抽酶切鑒定。以確認(rèn)得到的質(zhì)粒的大小和質(zhì)粒中插入片斷的大小與預(yù)期結(jié)果是否相符。
取3-5個(gè)酶切鑒定正確的克隆去測(cè)序,以zuì終確認(rèn)得到的克隆是否是預(yù)期的突變克隆。通常大約每2個(gè)克隆中會(huì)得到一個(gè)預(yù)期的突變克隆。但有時(shí)也可能會(huì)因?yàn)殡S機(jī)因素,會(huì)測(cè)序了3-5個(gè)克隆才得到一個(gè)預(yù)期的突變克隆。
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