BTN100212 一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖?/h1>

• 
• 
• 

• 產(chǎn)品/服務(wù)：BTN100212 一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖?/strong>
• 型 號(hào)：BTN100212
• 品 牌：百奧萊博
• 單 價(jià)：面議 
• 更新日期：2023-04-03
• 有效期至：長(zhǎng)期有效
• 瀏覽次數(shù)：1032
• 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖惺歉咂焚|(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖械然蚪Y(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的客戶，請(qǐng)到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

產(chǎn)品詳細(xì)介紹

特別提示：包括一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖性趦?nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖?br /> 英文名稱：One-Tube Mutagenesis Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：BTN100212
產(chǎn)品規(guī)格：10次

基因的定點(diǎn)突變是重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于載體構(gòu)建、基因改造、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域。但傳統(tǒng)的方法需要使用單鏈DNA 模板，而得到單鏈DNA 模板又需要先將基因克隆到類似M13 這種載體中，操作過程冗長(zhǎng)。為了克服這些缺點(diǎn)，本公司將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)到一對(duì)互補(bǔ)的引物中，用高保真擴(kuò)增質(zhì)粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通過互補(bǔ)形成帶切口的雙鏈質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 直接使用質(zhì)粒DNA作為模板，免去了制備單鏈DNA的步驟。
2.基于高保真PCR，對(duì)模板DNA 序列沒特殊要求，可以用于突變?nèi)魏涡蛄?。同時(shí)對(duì)模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一個(gè)優(yōu)化的緩沖體系中完成，非常簡(jiǎn)單。
4. 使用Dpn I 去除未突變模板，突變效率高達(dá)90%。
5.可用于制備點(diǎn)突變，缺失突變和插入突變。
6. 本產(chǎn)品A型適用于8 kb以下，B型適用于8-15 kb。

試劑盒組成：

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	無
高保真酶B型	無	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	無
5×高保真酶Buffer B型	無	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超純水	1ml	1ml

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物設(shè)計(jì)及注意事項(xiàng)
用于特定基因突變的引物必須用戶單獨(dú)設(shè)計(jì)，請(qǐng)參考如下一些基本原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。
1. 共需設(shè)計(jì)兩條完全互補(bǔ)的一對(duì)引物，它們覆蓋要擴(kuò)增的突變區(qū)位點(diǎn)，突變位點(diǎn)zuì好放在引物的中心。可以先集中設(shè)計(jì)一條，然后就可得互補(bǔ)的另一條引物。
2.引物的長(zhǎng)度通常為25-45個(gè)堿基。引物中突變位點(diǎn)任何一側(cè)都必需滿足Tm大于45的條件，Tm 計(jì)算方式為Tm=4×(GC 堿基數(shù))＋2×(AT 堿基數(shù))。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，它的突變位點(diǎn)AAG 所放位置使左側(cè)Tm＝46；右側(cè)Tm＝48，均大于45。
3. 盡量把引物的GC含量控制在40％-60％，結(jié)尾的1-3個(gè)堿基zuì好是G或C。
4. 盡量使引物不要產(chǎn)生非常穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體。
5. zuì好使用經(jīng)過PAGE 純化的引物或更高純度的引物。

二、待突變模板質(zhì)粒的選擇
1. 必需使用從dam＋的大腸桿菌(這類菌中質(zhì)粒可以被甲基化)中抽提得到的質(zhì)粒用于基因定點(diǎn)突變，否則Dpn I 不能把沒有酶切的質(zhì)粒DNA 切除，產(chǎn)生大量的假陽性。常用的大部分大腸桿菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌種。
2. 待突變質(zhì)粒和目的基因的GC含量應(yīng)該在40-55％，沒有任何GC含量超過70%、長(zhǎng)度在50bp以上的區(qū)域。如果質(zhì)粒GC含量過高，請(qǐng)先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進(jìn)行基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。如果目的基因GC含量過高，而突變位點(diǎn)不在高GC含量區(qū)域，可以先把該基因的不含高GC含量的一個(gè)區(qū)域克隆出來，進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果突變位點(diǎn)在高GC 區(qū)，則可以使用高GC 專用PCR反應(yīng)試劑。

三、基因定點(diǎn)突變反應(yīng)
1.在一個(gè)塑料離心管中加入下列成分：

待突變模板質(zhì)粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
補(bǔ)水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混勻，如果PCR儀沒有熱蓋則需要加少量石蠟油。放入PCR儀器中按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
變性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	長(zhǎng)時(shí)間保持

四、Dpn I消化
PCR反應(yīng)后，直接在PCR反應(yīng)體系中加入1μL Dpn I內(nèi)切酶(該酶在甘油保存液中會(huì)下沉到管底，故用前需要充分混勻)。DpnI可以酶切雙鏈都被甲基化的模板質(zhì)粒，也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質(zhì)粒?；靹蚝?7℃孵育2小時(shí)后樣品可以直接用于轉(zhuǎn)化，或者-20℃保存?zhèn)溆谩?br />
五、轉(zhuǎn)化、挑克隆鑒定：
每100 微升感受態(tài)細(xì)菌(轉(zhuǎn)化效率必須在107/μg以上)中可以加入5-10微升經(jīng)過Dpn I 消化后的突變產(chǎn)物，按照所使用的感受態(tài)細(xì)菌的操作方法進(jìn)行操作。如果PCR 使用了石蠟油，在轉(zhuǎn)化時(shí)千萬別把它帶入轉(zhuǎn)化反應(yīng)，否則會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率。
在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌全部涂布到含有適當(dāng)抗生素的平板上培養(yǎng)過夜。通常會(huì)得到50個(gè)以下的克隆，可按常規(guī)方法制備質(zhì)粒并測(cè)序。

六、常見問題：
1.轉(zhuǎn)化后沒有克隆或克隆數(shù)少：
(1)感受態(tài)細(xì)菌效率不夠高，請(qǐng)檢測(cè)一下感受態(tài)細(xì)胞的效率，確保轉(zhuǎn)化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的產(chǎn)物用常規(guī)的乙醇沉淀濃縮，這樣就可以把所有的產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化。
(3)優(yōu)化基因定點(diǎn)突變中的PCR參數(shù)。可以把zuì初的95℃變性時(shí)間延長(zhǎng)為2分鐘，循環(huán)中95℃變性的時(shí)間延長(zhǎng)至1分鐘，把循環(huán)中的68℃的延伸時(shí)間改為1.5分鐘/kb 至2分鐘/kb，退火可以改為60-55℃或65-55℃等的touch down，退火時(shí)間也可以適當(dāng)延長(zhǎng)。
(4)引物設(shè)計(jì)有問題。通過突變反應(yīng)中的PCR 沒有很好地?cái)U(kuò)增出預(yù)期的突變質(zhì)粒。
2.有克隆，但沒有或很難檢測(cè)到預(yù)期的突變克?。?br /> 使用的待突變的模板質(zhì)粒量過多，導(dǎo)致Dpn I 消化時(shí)不完全，可減少質(zhì)粒用量。
3. 有突變克隆，但突變位點(diǎn)不是預(yù)期的位點(diǎn)：
(1)引物設(shè)計(jì)不佳，退火溫度過低，導(dǎo)致引物退火到錯(cuò)誤的地方。
(2)引物質(zhì)量較差，沒有經(jīng)過PAGE 純化。這樣引物中通常會(huì)含有比設(shè)計(jì)的引物要短的特異性較差的引物，容易導(dǎo)致非預(yù)期的突變。

根據(jù)您的關(guān)注的一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖?/strong>，您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求：


ZN0279 CDX2 mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0423 DVL1 mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0432 EAAT1/Glast mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0551 GABRG2 mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0733 IL6ST mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0958 NEBULIN mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN1016 NPPA mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN1239 RXR mRNA原位雜交試劑盒 100T

關(guān)注一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖?/strong>，的同時(shí)，為您推薦更多您可能感興趣的產(chǎn)品：



名稱：ACVR2A mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0022
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.ACVR2A mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時(shí)。某些組織對(duì)過度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
ACVR2A的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

如果您覺得“BTN100212 一管式點(diǎn)突變?cè)噭┖小泵枋鲑Y料不夠齊全，請(qǐng)聯(lián)系我們獲取詳細(xì)資料。(聯(lián)系時(shí)請(qǐng)告訴我從給覽網(wǎng)看到的，我們將給您最大優(yōu)惠！)
本頁鏈接：http://jssdj.com/com_bjbiolab01/sell/itemid-8558292.html
已經(jīng)有1032位訪客查看了本頁.