一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑是高品質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的客戶(hù)，請(qǐng)到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱(chēng)：一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒
英文名稱(chēng)：One Step microRNA cDNA Synthesis Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：MT0005
產(chǎn)品規(guī)格：25T|100T

由于miRNA(microRNA)分子序列較小，僅20nt左右，沒(méi)有真核生物特有的Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，采用傳統(tǒng)Oligo dT引物和隨機(jī)引物很難獲得從miRNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前普遍采用的解決方案有兩種：特異性反轉(zhuǎn)錄引物（下圖A所示）、兩步加A法反轉(zhuǎn)錄方案（下圖B所示）。Biorab公司開(kāi)發(fā)出一套全新的一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，可以對(duì)成熟的miRNA同時(shí)完成Poly(A)反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，直接獲得含有特異性tag和15(T)的cDNA產(chǎn)物（下圖C所示）。該方法使得miRNA反轉(zhuǎn)錄與mRNA的反轉(zhuǎn)錄一樣輕松,直接將提取的microRNA與反應(yīng)緩沖液混合物混合并置于PCR儀上1小時(shí)即可獲得高濃度的、包含所有miRNA分子的cDNA產(chǎn)物,獲得的cDNA產(chǎn)物適合于采用SYBR Green染料法進(jìn)行RealTime PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。



產(chǎn)品組成：

組分	MT000(25T)	MT0005B(100T)
4×One step miRNA RT Solution	125μl	500μl
10×miRNA RT Primer	50μl	200μl
RNase Free H2O	1ml	1ml×2

儲(chǔ)存：請(qǐng)置于-20℃，可保存2年，避免反復(fù)凍融。
注：如4×One step miRNA RT Solution出現(xiàn)沉淀屬正?，F(xiàn)象，可用手捂化，混合均勻后使用不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

特別說(shuō)明： 10×miRNA RT Primer 引物為5"-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3"，定量擴(kuò)增用特異性上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，下圖2是以 hsa-miR-21 為實(shí)例說(shuō)明特異性上下游引物的設(shè)計(jì)方法（Biorab的microRNA 熒光定量 PCR 試劑盒提供所有 miRNA 檢測(cè)，貨號(hào)：MTAXXXXX，所有引物均經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)優(yōu)化，詳細(xì)請(qǐng)于引物列表中查詢(xún)。如果您研究的miRNA分子不在列表中，請(qǐng)來(lái)信咨詢(xún)，我們將及時(shí)給您優(yōu)化設(shè)計(jì)）。

圖1：技術(shù)原理圖：


圖2：hsa-miR-21實(shí)例設(shè)計(jì)原理：


操作方法：

1．按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

模板	miRNA	0.01-0.1μg
	Total RNA	0.1-2μg
4×One step miRNA RT Solution		5μl
10×miRNA RT Primer		2μl
Rnase-Free H2O		Up to 20μl

2. 在PCR 儀上按以下條件進(jìn)行反應(yīng)：
  37℃——————60min
  95℃——————5分鐘
3．獲得 cDNA 產(chǎn)物后使用microRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進(jìn)行 miRNA 定量檢測(cè)。使用該試劑盒反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA 產(chǎn)物包含了樣品中所有miRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可用于多個(gè)基因的檢測(cè)分析，可使用內(nèi)參基因進(jìn)行定量矯正。內(nèi)參基因可選擇使用RNU6B miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號(hào)：MTA01501)，適用于來(lái)源于人和鼠等哺乳動(dòng)物的樣品；RNU44 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號(hào)：MTA01502)、 RNU48 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號(hào)：MTA01503)，適用于來(lái)源于人的樣品；SnoRNA135 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號(hào)：MTA01504) 、SnoRNA202 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號(hào)：MTA01505)適用于來(lái)源于鼠的樣品。Biorab 提供的內(nèi)參擴(kuò)增引物濃度均為 10μM，每 20μl 反應(yīng)體系中加入0.4-0.8μl。
根據(jù)機(jī)型選擇步驟A或B，配制反應(yīng)體系：
步驟A: 需要添加 ROX 染料進(jìn)行反應(yīng)孔間信號(hào)矯正的Real-Time PCR 儀，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應(yīng)體系：

加入物	加入量	終濃度
5×Top HS SYBR Green qPCR Mix	4μl	1×
50×ROX Reference Dye	0.4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4-0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM)	0.4-0.8μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

注：引物初次使用請(qǐng)用0.4μl，視實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
步驟B:無(wú)需添加 ROX 染料進(jìn)行反應(yīng)孔間信號(hào)矯正的Real-Time PCR 儀，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應(yīng)體系：

加入物	加入量	終濃度
5×Top HS SYBR Green qPCR Mix	4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4-0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM)	0.4-0.8μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

4．進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng)，通常采用兩步法，程序如下：

步驟	加入量	終濃度	循環(huán)數(shù)
Stage 1：	95℃	15分鐘
Stage 2：	95℃	5s
	60℃	30s	30cycles
Stage 3：	Dissociation analysis

注意：使用該方法通?？梢詼?zhǔn)確檢測(cè)到>0.01fM的microRNA 分子，過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成性降低。推薦的循環(huán)數(shù)為 30 個(gè)，在檢測(cè)低樣品濃度時(shí)可將循環(huán)數(shù)調(diào)整到35 個(gè)。
5．?dāng)U增結(jié)果分析和數(shù)據(jù)處理：
反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-Time PCR的cDNA 樣品和 NTC 陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)。


根據(jù)您的關(guān)注的一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求：



名稱(chēng)：DOP-PCR試劑盒
貨號(hào)：BTN111109
規(guī)格：50次
DOP-PCR即簡(jiǎn)并寡聚核苷酸引物PCR，是擴(kuò)增全基因組的方法之一，它利用中間含有6個(gè)隨機(jī)堿基的22nt引物，通過(guò)兩輪PCR(輪低溫復(fù)性，第二輪高溫復(fù)性)而將模板DNA擴(kuò)增。DOP-PCR擴(kuò)完整基因組的效率不如利用phi 29 DNA聚合酶的MDA，但在擴(kuò)增高度降解的痕量DNA 方面具有巨大，在法醫(yī)鑒定領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。本產(chǎn)品就是在DOP-PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化而開(kāi)發(fā)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 專(zhuān)門(mén)用于高度降解的DNA，方便，含有除模板DNA和引物以外的所有成份，簡(jiǎn)化了準(zhǔn)備工作。
2. 優(yōu)化的引物濃度，使自連序列和非模板相關(guān)序列的合成。
3. 使用高保真酶，降低突變率。
4. 長(zhǎng)度在300-1700bp 之間，平均500bp左右。
5. 模板基因DNA 用量一般為10-100pg。
6. 所得PCR產(chǎn)物可用于STR 多重?cái)U(kuò)增、比較基因組雜交、單染色體文庫(kù)構(gòu)建、基因組圖譜研究等。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
DOP-PCR Magic Mix	750μl
DOP-PCR引物(20pmol/μL)	250μL
超純水	1ml
說(shuō)明書(shū)	1份

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。不要反復(fù)凍融。

使用方法：

1.在一干凈的PCR 管中，加入下列成分：

成分	陰性對(duì)照	樣品
DOP-PCR MagicMix	25μL	25μL
基因組DNA模板(自備)或單個(gè)細(xì)胞	不加	10-100pg(或一個(gè)單個(gè)細(xì)胞)
DOP-PCR引物(20 pmol/μL)	5μl	5μl
補(bǔ)水到	50μl	50μl

2. 放入PCR儀中按下列參數(shù)進(jìn)行DOP-PCR。

預(yù)變性	95℃	5min
輪PCR(12個(gè)循環(huán))	94℃	1min
	30℃	1.5min
	72℃(30℃升到72℃的時(shí)間設(shè)定為3分鐘)	3min
第二輪PCR(35個(gè)循環(huán))	94℃	1min
	62℃	1min
	72℃(每次循環(huán)后此步的保溫時(shí)間延長(zhǎng)14秒)	2min
延伸	72℃	7min
	4℃	Forever

3.結(jié)束后取5-10μl直接上樣電泳(不需要額外再加DNA上樣液)，紅色染料電泳速度相當(dāng)于50bp DNA片段。DOP-PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度一般在300-1700bp之間。
4. 所得DOP-PCR產(chǎn)物可以用于后續(xù)PCR檢測(cè)或其他分析。

關(guān)注一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，的同時(shí)，為您推薦更多您可能感興趣的產(chǎn)品：

貨號(hào)	名稱(chēng)	規(guī)格
WE0241	二代測(cè)序接頭引物試劑盒(Illumina平臺(tái) Index Primer1-12)	24次|96次
ZN0030	ADMR mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0054	Amelogenin/MAME mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0117	Bag-1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0184	CARD10 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0197	Caspase-7 mRNA原位雜交試劑盒	100T

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