北京百奧萊博供應(yīng)的DOP-PCR試劑盒用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價位合理，需要DOP-PCR試劑盒等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的客戶，請到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括DOP-PCR試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DOP-PCR試劑盒
英文名稱：Degenerate Oligonucleotide Primer PCR Kit
產(chǎn)品貨號：BTN111109
產(chǎn)品規(guī)格：50次

DOP-PCR即簡并寡聚核苷酸引物PCR，是擴(kuò)增全基因組的方法之一，它利用中間含有6個隨機(jī)堿基的22nt引物，通過兩輪PCR(輪低溫復(fù)性，第二輪高溫復(fù)性)而將模板DNA擴(kuò)增。DOP-PCR擴(kuò)完整基因組的效率不如利用phi 29 DNA聚合酶的MDA，但在擴(kuò)增高度降解的痕量DNA 方面具有巨大，在法醫(yī)鑒定領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。本產(chǎn)品就是在DOP-PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化而開發(fā)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 專門用于高度降解的DNA，方便，含有除模板DNA和引物以外的所有成份，簡化了準(zhǔn)備工作。
2. 優(yōu)化的引物濃度，使自連序列和非模板相關(guān)序列的合成。
3. 使用高保真酶，降低突變率。
4. 長度在300-1700bp 之間，平均500bp左右。
5. 模板基因DNA 用量一般為10-100pg。
6. 所得PCR產(chǎn)物可用于STR 多重?cái)U(kuò)增、比較基因組雜交、單染色體文庫構(gòu)建、基因組圖譜研究等。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
DOP-PCR Magic Mix	750μl
DOP-PCR引物(20pmol/μL)	250μL
超純水	1ml
說明書	1份

儲存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存，保存期限為12個月。不要反復(fù)凍融。

使用方法：

1.在一干凈的PCR 管中，加入下列成分：

成分	陰性對照	樣品
DOP-PCR MagicMix	25μL	25μL
基因組DNA模板(自備)或單個細(xì)胞	不加	10-100pg(或一個單個細(xì)胞)
DOP-PCR引物(20 pmol/μL)	5μl	5μl
補(bǔ)水到	50μl	50μl

2. 放入PCR儀中按下列參數(shù)進(jìn)行DOP-PCR。

預(yù)變性	95℃	5min
輪PCR(12個循環(huán))	94℃	1min
	30℃	1.5min
	72℃(30℃升到72℃的時間設(shè)定為3分鐘)	3min
第二輪PCR(35個循環(huán))	94℃	1min
	62℃	1min
	72℃(每次循環(huán)后此步的保溫時間延長14秒)	2min
延伸	72℃	7min
	4℃	Forever

3.結(jié)束后取5-10μl直接上樣電泳(不需要額外再加DNA上樣液)，紅色染料電泳速度相當(dāng)于50bp DNA片段。DOP-PCR產(chǎn)物的長度一般在300-1700bp之間。
4. 所得DOP-PCR產(chǎn)物可以用于后續(xù)PCR檢測或其他分析。

根據(jù)您的關(guān)注的DOP-PCR試劑盒，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：CXCR3 mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0349
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：rat,mouse
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.CXCR3 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
CXCR3的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時，用預(yù)雜交液對含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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貨號	名稱	規(guī)格
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ZN0631	HBG mRNA原位雜交試劑盒	100T
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