通用型反轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科學(xué)研究，我公司專注于基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的通用型反轉(zhuǎn)錄試劑盒質(zhì)量可靠，批間差小，且價(jià)格公道，熱切盼望您選購(gòu)我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括通用型反轉(zhuǎn)錄試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：通用型反轉(zhuǎn)錄試劑盒
英文名稱：Universal RT-PCR Kit(M-MLV, free Taq polymerase)
產(chǎn)品貨號(hào)：QN2089
產(chǎn)品規(guī)格：50T|100T

本試劑盒適用于各種 RNA 制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。它采用 M-MLV 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于后續(xù)的 PCR 擴(kuò)增和分子克隆實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒中配置的酶為進(jìn)口的酶。RT 酶采用進(jìn)口的 M-MLV，所以 cDNA 更長(zhǎng)，基因的信息保留得更完整！反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中特異的 RNase 抑制劑可有效降低由于外源 RNase 污染而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。本試劑盒使用方便、快捷，可廣泛用于 cDNA 克隆及目的基因檢測(cè)等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

試劑盒組成 ：

組分	50T	100T
M-MLV(200U/μL)	50μL	50μL×2
5×M-MLV Buffer	200μL	400μL
Oligo(dT)16(10uM)	100μL	200μL
RNasin(40U/μL)	25μL	50μL
dNTPs(10mM)	50μL	100μL
RNase-free ddH2O	1mL	1mL×2
說(shuō)明書(shū)	1份	1份

保存：-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期1年

操作步驟(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)) ：
1、在冰浴的無(wú) RNase 的離心管中加入如下反應(yīng)成分：
  1-5μg 總 RNA 或 50-500ng mRNA
  2μL Oligo(dT)16或 2 pmole 基因特異性引物
  補(bǔ) RNase-free ddH2O 至 14.5μL
2、70℃保溫 5min 后迅速在冰上冷卻 2min，簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液后加入以下各組分：
  4μL 5×M-MLV Buffer
  1μL dNTPs
  0.5μL RNasin
  1μL M-MLV
3、42℃溫浴 60min，如果是用隨機(jī)引物，請(qǐng)先將離心管置 25℃溫浴 10min，再 42℃溫浴 60min。
4、95℃加熱 5min 終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。
5、若用于后續(xù)PCR擴(kuò)增,用 RNase-free ddH2O 將反應(yīng)體系稀釋到 50μL，取2-5μL作為 PCR 反應(yīng)模板。

注意事項(xiàng) ：
1、用于 cDNA 合成反應(yīng)的相關(guān)試劑和耗材盡可能用 DEPC 進(jìn)行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能高壓滅菌時(shí)，先用經(jīng)過(guò)滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌處理。
2、試劑盒的各組分應(yīng)在-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。
3、RNA 樣品要避免反復(fù)多次凍融，應(yīng)使 RNA 在冰浴中處于融化狀態(tài)。

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名稱：ARNTL mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0090
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：mouse
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.ARNTL mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過(guò)氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過(guò)度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長(zhǎng)好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開(kāi)后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過(guò)夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過(guò)氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過(guò)4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過(guò)2小時(shí)。某些組織對(duì)過(guò)度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過(guò)1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
ARNTL的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過(guò)不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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