DNA文庫構(gòu)建試劑盒（illum由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品僅用于生物化學(xué)研究方面，我公司的DNA文庫構(gòu)建試劑盒（illum品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括DNA文庫構(gòu)建試劑盒（illumina)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DNA文庫構(gòu)建試劑盒（illumina)
英文名稱：DNA Library Construction Kit（illumina)
產(chǎn)品貨號(hào)：WH0200
產(chǎn)品規(guī)格：24次|96次

  本試劑盒是專門針對(duì)于illumina高通量測序平臺(tái)所優(yōu)化的DNA文庫構(gòu)建試劑盒。由末端修復(fù)（End-Repair Mix）、A尾添加（A-Tailing Mix）和接頭連接（Ligation Mix）三個(gè)模塊構(gòu)成。與同類試劑不同的是：本產(chǎn)品所含有的模塊均為一管式包裝，且經(jīng)特殊工藝加工呈凍干粉狀，大增強(qiáng)了試劑穩(wěn)定性，可在室溫條件下運(yùn)輸，保存和實(shí)驗(yàn)操作，省去了體系配制，低溫保藏等繁瑣操作，使得操作更加簡便，文庫轉(zhuǎn)化效率更高。
  適用范圍：適用于illumina高通量測序平臺(tái)DNA文庫構(gòu)建。
  適用樣本量：10ng～1μg DNA。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
·凍干粉形式，單管酶促反應(yīng)，一管完成一步反應(yīng)。
·高文庫轉(zhuǎn)化效率，DNA樣本起始量可低至10ng。
·操作簡便，省去體系配制，低溫保藏等步驟。

試劑盒組成：

組分	24次	96次
End-Repair Mix	24支	96支
A-Tailing Mix	24支	96支
Ligation Mix	24支	96支

保存條件：15～25℃保存，保質(zhì)期為一年。開封未使用完的組份（末端修復(fù)、A尾添加和接頭連接等試劑凍干粉）經(jīng)自封鋁箔袋封裝后可在室溫條件下保存，并在2個(gè)月內(nèi)將所有組份用完。

注意事項(xiàng)請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)
1．操作過程請(qǐng)注意避免核酸樣品和產(chǎn)物之間的交叉污染。
2．請(qǐng)使用不含RNA酶或DNA酶的槍頭、EP管進(jìn)行試驗(yàn)。
3．試驗(yàn)開始前，請(qǐng)清潔操作臺(tái)，并使用RNA酶及DNA酶清除試劑，如RNase Away處理臺(tái)面。確保沒有RNA酶和DNA的污染。
4．進(jìn)行文庫擴(kuò)增前，請(qǐng)確保PCR儀已經(jīng)調(diào)試好并處于穩(wěn)定的狀態(tài)。
5．試驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書，如果需要暫停試驗(yàn)，或者無需立即進(jìn)行下游試驗(yàn)?？筛鶕?jù)說明書推薦將試驗(yàn)產(chǎn)物保存于-20℃并安排后續(xù)試驗(yàn)。

操作流程：



使用本試劑盒以大腸桿菌DNA為例，樣本DNA起始量與經(jīng)qPCR定量得到的文庫DNA量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

操作步驟：

一、DNA片段化
本試劑盒不包含DNA片段化相關(guān)試劑。對(duì)于DNA的片段化過程，客戶可在超聲處理、化學(xué)處理和酶處理等常用方法中選擇，具體操作請(qǐng)參考相關(guān)產(chǎn)品說明。

二、末端修復(fù)
1．沿錫箔紙封口袋頂部切口位置撕開試劑包裝袋。
2．取出一支管蓋呈藍(lán)色的1.5ml離心管用于末端修復(fù)反應(yīng)。每支1.5ml離心管中所含的凍干粉試劑可供一次文庫構(gòu)建反應(yīng)使用。
3．如有需要，可瞬時(shí)離心以確保凍干粉聚集于離心管底。
4．按下表建立末端修復(fù)反應(yīng)體系：

成分	使用量
雙鏈DNA片段（10ng-1μg)	X μl
ddH2O	100-X μl

5．用移液器輕柔吸打6～8次混勻反應(yīng)體系。
6．20℃孵育30min。
7．使用AMPure@ XP磁珠純化末端修復(fù)產(chǎn)物。
8．純化開始前將AMPure@ XP磁珠平衡至室溫。
9．使用前將AMPure@ XP磁珠渦旋使其充分懸浮。
10．若反應(yīng)管與磁力架不兼容，可將末端補(bǔ)平反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至與磁力架兼容的離心管中。
  注：此離心管須能夠容納260μl液體。
11．每100 μl末端修復(fù)反應(yīng)液中加入160 μl AMPure@ XP磁珠，吸打混勻至少5次。
12．室溫放置5 min。
13．將含磁珠的反應(yīng)液置磁力架上3 min，待溶液變清澈。
14．用移液器分兩次吸除上清，每次128 μl。注意在吸入上清的過程中不要擾動(dòng)磁珠，除去上清后管底剩余少量液體不影響后續(xù)試驗(yàn)。
15．保持反應(yīng)管置于磁力架上，向反應(yīng)管管底輕柔加入200 μl 80%乙醇（注意不要擾動(dòng)磁珠），室溫孵育30 sec。
16．小心去除80%乙醇（~200 μl），不要擾動(dòng)磁珠。
17．用80%乙醇重復(fù)洗滌一次（步驟15-16）。
18．將反應(yīng)管瞬時(shí)離心后置于磁力架上，使用<20 μl量程的移液器小心去除管底殘留的乙醇。
19．將反應(yīng)管開蓋置于磁力架上，室溫干燥5 min
20．將反應(yīng)管從磁力架上取下，加入52.5 μl洗脫緩沖液（10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去離子水）。用移液器吸打使磁珠懸浮。
21．將反應(yīng)管置于磁力架上3 min，待溶液澄清。小心吸取上清至新離心管。
22．立刻進(jìn)入A尾添加程序或?qū)a(chǎn)物保存于-20℃ （末端補(bǔ)平產(chǎn)物可在-20℃保存7天）。

三、A尾添加
1．沿錫箔紙封口袋頂部切口位置撕開試劑包裝袋。
2．取出一支管蓋呈黃色的1.5ml離心管用于A尾添加反應(yīng)。每支1.5ml離心管中所含的凍干粉試劑可供一次文庫構(gòu)建反應(yīng)使用。
3．如有需要，可瞬時(shí)離心以確保凍干粉聚集于離心管底。
4．向反應(yīng)管內(nèi)加入50 μl末端修復(fù)后的DNA純化產(chǎn)物（末端修復(fù)之步驟22）。
5．用移液器輕柔吸打6～8次混勻反應(yīng)體系。
6．30℃孵育30min。
7．使用AMPure@ XP磁珠純化A尾添加產(chǎn)物。
8．純化開始前將AMPure@ XP磁珠平衡至室溫。
9．使用前將AMPure@ XP磁珠渦旋使其充分懸浮。
10．若反應(yīng)管與磁力架不兼容，可將A尾添加反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至與磁力架兼容的離心管中。
  注：此離心管須能夠容納200 μl液體。
11．每50 μl末端修復(fù)反應(yīng)液中加入90 μl AMPure@ XP磁珠，吸打混勻至少5次。
12．室溫放置5 min。
13．將含磁珠的反應(yīng)液置磁力架上3 min，待溶液變清澈。
14．用移液器吸除上清，約135 μl。
注：吸入上清的過程中不要擾動(dòng)磁珠，除去上清后管底剩余少量液體不影響后續(xù)試驗(yàn)。
15．保持反應(yīng)管置于磁力架上，向反應(yīng)管管底輕柔加入200 μl 80%乙醇（注意不要擾動(dòng)磁珠），室溫孵育30 sec。
16．小心去除80%乙醇（~200 μl），不要擾動(dòng)磁珠。
17．用80%乙醇重復(fù)洗滌一次（步驟15-16）。
18．將反應(yīng)管瞬時(shí)離心后置于磁力架上，使用<20 μl量程的移液器小心去除管底殘留的乙醇。
19．將反應(yīng)管開蓋置于磁力架上，室溫干燥5 min。磁珠干燥期間請(qǐng)計(jì)算接頭連接過程中所需的DNA量（X）以及接頭用量（接頭連接步驟中第4步）。
  注：文庫DNA與接頭在適當(dāng)?shù)哪柋确秶鷥?nèi)可以增加接頭連接效率，進(jìn)而提高文庫質(zhì)量和豐度。另外，使用過小體積溶液洗脫會(huì)造成DNA得率顯著降低，故應(yīng)使X≥20 μl。
20．將反應(yīng)管從磁力架上取下，加入（X+2.5) μl洗脫緩沖液（10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去離子水）。用移液器吸打使磁珠懸浮。
21．將反應(yīng)管置于磁力架上3 min，待溶液澄清。小心吸取上清至新離心管。
22．直接進(jìn)入接頭連接步驟或?qū)a(chǎn)物保存于-20℃（添加A尾后的DNA產(chǎn)物可在-20℃保存7天）。

四、接頭連接
1．沿錫箔紙封口袋頂部切口位置撕開試劑包裝袋。
2．取出一支管蓋呈紫色的1.5ml離心管用于末端修復(fù)反應(yīng)。每支1.5ml離心管中所含的凍干粉試劑可供一次文庫構(gòu)建反應(yīng)使用。
3．如有需要，可瞬時(shí)離心以確保凍干粉聚集于離心管底。
4．按下表建立接頭連接反應(yīng)體系：

成分	使用量
添加A尾后DNA純化產(chǎn)物	X μl
DNA接頭*	Y μl
總體系	50μl

注：本試劑盒中不含DNA接頭。接頭用量需根據(jù)文庫DNA片段用量進(jìn)行調(diào)整。推薦接頭產(chǎn)品為Single-Indexed Adapter （Illumina? Platforms)（WH0206-01/02/03）。該產(chǎn)品說明書中詳細(xì)給出了不同情況下，DNA片段與接頭的zuì佳摩爾比，客戶可進(jìn)行參考。若使用其他公司的接頭產(chǎn)品，則需參考其說明書操作。
5．用移液器輕柔吸打6～8次混勻反應(yīng)體系。
6．20℃孵育15 min。
7．使用AMPure@ XP磁珠純化末端修復(fù)產(chǎn)物。
8．純化開始前將AMPure@ XP磁珠平衡至室溫。
9．使用前將AMPure@ XP磁珠渦旋使其充分懸浮。
10．若反應(yīng)管與磁力架不兼容，可將末端補(bǔ)平反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至與磁力架兼容的離心管中。
  注：此離心管須能夠容納200 μl液體。
11．每50 μl末端修復(fù)反應(yīng)液中加入50 μlAMPure@ XP磁珠，吸打混勻至少5次。
12．室溫放置5 min。
13．將含磁珠的反應(yīng)液置磁力架上3 min，待溶液變清澈。
14．用移液器吸除上清，約95 μl。
  注：在吸入上清的過程中不要擾動(dòng)磁珠，除去上清后管底剩余少量液體不影響后續(xù)試驗(yàn)。
15．保持反應(yīng)管置于磁力架上，向反應(yīng)管管底輕柔加入200 μl 80%乙醇（注意不要擾動(dòng)磁珠)，室溫孵育30 sec。
16．小心去除80%乙醇（~200 μl），不要擾動(dòng)磁珠。
17．用80%乙醇重復(fù)洗滌一次（步驟15-16）。
18．將反應(yīng)管瞬時(shí)離心后置于磁力架上，使用<20 μl量程的移液器小心去除管底殘留的乙醇。
19．將反應(yīng)管開蓋置于磁力架上，室溫干燥5 min。磁珠干燥期間請(qǐng)計(jì)算片段篩選過程中所需的DNA量（Z）。
  注：由于不同的片段選擇方法所需的上樣量不同，用戶可以根據(jù)后續(xù)片段篩選方法確定接頭連接產(chǎn)物的洗脫體積（Z+2.5 μl）。其中，推薦Z的取值范圍為：20≤Z≤100。如果不進(jìn)行片段篩選，則推薦再次使用AMPure@ XP磁珠進(jìn)行純化以降低接頭污染（50 μl接頭連接產(chǎn)物加入50 μl磁珠，Z=50 μl）。如果不明確如何選擇Z值，請(qǐng)參閱說明書第五部分。
20．將反應(yīng)管從磁力架上取下，加入（Z+2.5) μl洗脫緩沖液（10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去離子水）。用移液器吸打使磁珠懸浮。
21．將反應(yīng)管置于磁力架上3 min，待溶液澄清。小心吸取上清至新離心管。
22．小心吸取上清Z μl至新離心管，直接進(jìn)入說明書第五部分或?qū)a(chǎn)物保存于-20℃（接頭連接后的DNA產(chǎn)物可在-20℃保存7天）。

五、片段篩選
若使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測序或進(jìn)行基因組測序，文庫DNA片段平均大小應(yīng)為400 bp（包含接頭）。片段篩選步驟即旨在特異性地回收得到這部分片段，而去除過大或過小的雙鏈及單鏈DNA片段。以下是常用的片段篩選方法，以及使用這些方法時(shí)所需要的連接產(chǎn)物體積（Z）。
1．瓊脂糖凝膠回收（Z=20 μl）；
2．Sage Science Pippin PrepTM（Z=30 μl）；
3．Life TechnologiesTM E-Gel@ SizeSelectTM Gels（Z=20 μl）；
4．基于磁珠的片段篩選方法（Z=100 μl）。
注：片段篩選步驟一般在接頭連接后進(jìn)行，以控制文庫中DNA片段大小。但用戶也可以根據(jù)自身需要在末端修復(fù)完成后即進(jìn)行片段篩選。

六、文庫擴(kuò)增
本試劑盒不含PCR試劑及引物。用戶需要自行選擇PCR試劑，并根據(jù)文庫DNA上樣量確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。PCR結(jié)束后，可使用AMPure@ XP磁珠（Cat# A63881）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，并使用凝膠電泳、Qubit@、qPCR以及Angilent生物分析儀對(duì)純化后的DNA文庫進(jìn)行分析。推薦試劑為NGS文庫富集試劑（WH0210）。

根據(jù)您的關(guān)注的DNA文庫構(gòu)建試劑盒（illumina)，您可能還對(duì)以下產(chǎn)品有需求：



名稱：E2F-5 mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0430
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.E2F-5 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對(duì)mRNA的分解作用。此外，過度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時(shí)。某些組織對(duì)過度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
E2F-5的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對(duì)照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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ZN0207 Cathepsin G mRNA原位雜交試劑盒 100T
ZN0286 Chr-A mRNA原位雜交試劑盒 100T
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