3′RACE試劑盒是高品質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學(xué)研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價(jià)格，深為用戶稱道，了解更多3′RACE試劑盒等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品請聯(lián)系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括3′RACE試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：3′RACE試劑盒
英文名稱：3′-RACE Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：BTN101104
產(chǎn)品規(guī)格：10次

研究真核基因的zuì基礎(chǔ)的工作之一就是確定其轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，目前zuì通用的方法是3′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman發(fā)明的、通過PCR快速克隆cDNA末端的技術(shù)，它在不建立cDNA文庫的前提下，利用已知cDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過往兩端延伸和擴(kuò)增獲得其3′-端序列。本試劑盒就是根據(jù)3′-RACE原理而開發(fā)。RACE的原理如下圖：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 即開即用，客戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備各種材料。
2.反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，包括使用無RNase H活性的MMLV和優(yōu)化的引物。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶-RI混合物(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer(含dNTP)	50μl
PCR MagicMix 2.0(含酶和染料)	1.5ml
3′-RACE引物A(10μM)	10μl
3′-RACE引物B(10μM)	100μl
3′-RACE引物C(10μM)	100μl
RNase-Free水	1ml
說明書	1份

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、利用含Oligo(dT)的3′-RACE引物A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
 注意：MMLV酶使用前必須短暫離心，因?yàn)樗?0%甘油，及其粘稠，否則將取不到所需體積。
1.在一個(gè)PCR管中，加入以下組分：

成分	用量
Poly(A)RNA(或總RNA)	0.2-2μg(5μg)
3′-RACE引物A(10μM)	1μL
MMLV Buffer(含dNTP溶液)	5μL
RNase-Free水	補(bǔ)至19μL
合計(jì)	19μL

 注意：如果可能，zuì好使用Poly(A)RNA作為模板。
  65℃保溫5分鐘，展開RNA的二級結(jié)構(gòu)，立即冰浴待用。
2. 再在上述PCR管中加入1μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶-RI混合物(200U/μL)。
3. 37℃保溫60分鐘，42℃保溫30分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；然后50℃保溫10分鐘終止反應(yīng)。
4. 加入0.5mL RNase-free水稀釋上步得到的cDNA，冰浴待用。長期放置需要放-20℃保存。

二、利用基因?qū)Ｒ恍砸顰和3′RACE引物B進(jìn)行輪PCR
5. 用不同量的RT反應(yīng)液(稀釋后的cDNA)設(shè)置PCR(樣品組zuì好設(shè)置用量梯度，單位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
稀釋后的cDNA	1	5	10	15
基因?qū)Ｒ恍砸顰(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
3′RACE引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
98℃ 5分變性RNA-cDNA雜交鏈，短暫離心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0	25	25	25	25
RNase-free水	19	15	10	5
合計(jì)	50	50	50	50

6. 按下列條件進(jìn)行PCR(注：應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?。
 第1次循環(huán)：52-60℃ 2分，72℃ 40分(此步的目地是合成第二鏈的cDNA，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸顰的Tm值進(jìn)行優(yōu)化，一般可以從55℃開始)。
 第2-30次循環(huán)：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分，72℃ 3分(此步為PCR擴(kuò)增，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸顰的Tm值進(jìn)行優(yōu)化，一般可以從55℃開始)。
 zuì后延伸：72℃ 15分
7. 取5μl的PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。若得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物需要用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，可按下列步驟進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。

三、利用基因?qū)Ｒ恍砸顱和3′RACE引物C進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)
8. 將上輪PCR產(chǎn)物(4管)均用水稀釋稀釋20倍，然后每管均用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增。巢式PCR反應(yīng)設(shè)置如下：

成分	用量
PCR MagicMix 2.0	25μl
上步得到的PCR反應(yīng)液(稀釋20倍后)	1μl
基因?qū)Ｒ恍砸顱(10μm)	2.5μl
3′RACE引物C(10μm)	2.5μl
超純水	補(bǔ)至50μL

9. PCR反應(yīng)。按下列條件進(jìn)行PCR：
第1-30次循環(huán)：94℃ 1分鐘，52-60℃ 1分，72℃ 3分(復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸顱的Tm值進(jìn)行優(yōu)化，一般可以從55℃開始)zuì后延伸：72℃ 15分
10.電泳檢測。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行DNA測序或TA克隆。

注意事項(xiàng)：
1. 如果兩輪PCR得到的非特異產(chǎn)物多，可以在RT反應(yīng)是繼續(xù)降低3′-RACE引物A的用量。
2.自備的基因?qū)Ｒ恍砸锏腉C含量zuì好跟3′-RACE引物B和引物C的一致，后者長度均為18nt，均含11個(gè)G(或C)，7個(gè)A(或T)。

根據(jù)您的關(guān)注的3′RACE試劑盒，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：Acetylcholinesterase/ACHE mRNA原位雜交試劑盒
貨號(hào)：ZN0013
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse,rabbit
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
標(biāo)記方式：3’—尾段標(biāo)記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預(yù)雜交液 2ml；
3.Acetylcholinesterase/ACHE mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片
準(zhǔn)備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細(xì)胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時(shí)也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標(biāo)本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本。標(biāo)本離體后，及時(shí)予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時(shí)即可，較大的標(biāo)本固定不要超過2小時(shí)。某些組織對過度固定尤其敏感，如動(dòng)物大腦，固定時(shí)間30-40分鐘，一般不要超過1小時(shí)。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標(biāo)本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時(shí)間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時(shí)間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
Acetylcholinesterase/ACHE的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項(xiàng)：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個(gè)堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標(biāo)本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí)，用預(yù)雜交液對含探針的雜交液進(jìn)行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應(yīng)加強(qiáng)探針雜交后的洗滌。如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色，往往和標(biāo)本固定時(shí)間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標(biāo)本。

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