內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒是利用E系列探針進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的E04內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色探針為紅色熒光標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針，具有586nm/616nm的激發(fā)/發(fā)射波長。...

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒(紅色熒光)

 

產(chǎn)品編號：HR9083

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

染料-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。有效期6個月。

【注】：

● 染料短期2周內(nèi)可以2-8℃保存。染料長期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒(紅色熒光)產(chǎn)品簡介：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒是利用E系列探針進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性染色的試劑盒。本試劑盒中的E04內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色探針為紅色熒光標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針，具有586nm/616nm的激發(fā)/發(fā)射波長。

E系列探針是一種細(xì)胞滲透型的對活細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體進(jìn)行選擇性染色的一類新型熒光染料，該系列探針可以選擇性標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。只需簡單孵育細(xì)胞，即可穿過細(xì)胞膜并直接聚集在活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上?？捎行?biāo)記活細(xì)胞。一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被染色后，還能根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求進(jìn)行固定(醛類固定劑如甲醛)和透化(醛類去污劑如Triton X-100)，探針依然維持在細(xì)胞內(nèi)。

檢測方法：

● 熒光顯微鏡

● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞

● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● 離心機(jī)

● PBS ● 或者HBSS(無酚紅)

注意事項(xiàng)：

● E04染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進(jìn)行簡短離心使DMSO溶液集中于管底。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類而異，根據(jù)不同樣本的實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實(shí)驗(yàn)前，請先根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求、細(xì)胞類型、細(xì)胞的膜通透性等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。

● 最好使用HBSS緩沖液(含Ca²⁺、Mg²⁺ Hank’s平衡鹽溶液)稀釋該探針進(jìn)行染色，可得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

● E04染料具有環(huán)境敏感性，工作液條件發(fā)生改變E04 會隨之出現(xiàn)極性增強(qiáng)、最大熒光波長偏移到更高波長處、量子產(chǎn)量下降等現(xiàn)象。

● 染色后立即進(jìn)行分析。

● 操作過程中需要盡量避光。

使用方法：

1、染色工作液配制：

根據(jù)樣本數(shù)量，用37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱HBSS或PBS或其他緩沖液將E04熒光染料500倍稀釋。配制成染色工作液。(對于后續(xù)需要做固定或透化的樣本，200倍稀釋)

【注】：

● 建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)使用量，對母液進(jìn)行小量分裝，每次使用一管，試劑-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

● 開始實(shí)驗(yàn)前，使用HBSS或培養(yǎng)基緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度為試劑盒中染料母液的500倍稀釋。

● 為了降低過度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)毒性，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。另外，濃度過高也可能造成非特異性染色，對其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 為了降低探針加載過度可能引起的假陽性，建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 使用含Ca²⁺、Mg²⁺ Hank’s平衡鹽溶液(HBSS/Ca/Mg)稀釋該探針進(jìn)行染色，可得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

● 以下實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞優(yōu)化，且已被其他常規(guī)細(xì)胞系驗(yàn)證。但不同細(xì)胞類型其最佳使用條件不同，還需用戶根據(jù)該方案進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化染色濃度和時間。

2、細(xì)胞染色

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒(紅色熒光)2.1 對于貼壁細(xì)胞

1)培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板準(zhǔn)備細(xì)胞樣本。

2)待細(xì)胞生長到合適豐度，吸除培養(yǎng)液，用HBSS緩沖液洗滌細(xì)胞，加入適量37℃預(yù)熱的含探針工作液。于生長狀態(tài)下孵育15分鐘～40分鐘(具體孵育時間需根據(jù)細(xì)胞類型而定，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化)。

【注】：

● 也可以將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，加入合適培養(yǎng)基，使其爬片生長。

3)利用新鮮培養(yǎng)基替換上述染色液。

【注】：

● 若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

4)熒光顯微鏡(含合適濾片)或激光共聚焦顯微鏡下觀察?；蛘哌M(jìn)行后續(xù)的固定步驟。

激發(fā)/發(fā)射波長為586/616nm。

2.2 對于懸浮細(xì)胞

1)用HBSS洗滌細(xì)胞。

2)利用37℃預(yù)熱的探針工作液重懸細(xì)胞，于生長狀態(tài)下孵育15分鐘～40分鐘(具體時間需根據(jù)細(xì)胞類型而定，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化)。

3)離心，吸除染色液，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

4)置于熒光鏡下觀察?；蚣す夤簿劢癸@微鏡檢測。激發(fā)/發(fā)射波長為586/616nm。或者進(jìn)行后續(xù)的固定步驟。

【注】：

● 對于懸浮細(xì)胞，也可將細(xì)胞貼附于經(jīng)細(xì)胞粘合劑處理過的蓋玻片上，然后使用類似于貼壁細(xì)胞的方法進(jìn)行染色。

● 如果需要蓋玻片上固定化的細(xì)胞，那么可在鋪片前可以先用多聚賴氨酸(poly-D-lysine)包被載玻片或蓋玻片。

● 若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

● 已染色細(xì)胞用醛固定后，僅部分E04探針留在細(xì)胞內(nèi)，熒光信號會有衰減。

常見問題分析：

● 可以對細(xì)胞進(jìn)行固定嗎？

已染色細(xì)胞固定后，僅部分熒光探針留在細(xì)胞內(nèi)，熒光信號會有部分衰減。

 

● 固定細(xì)胞的方法？

染色后清洗，小心吸走清洗液。換用新鮮配制且預(yù)熱的含4%甲醛的緩沖液或培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞固定。用4%甲醛于37℃固定細(xì)胞2min。 細(xì)胞固定后，可用合適緩沖液進(jìn)行清洗，每次5min，共2次。清洗后可對細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)封片、鏡檢或進(jìn)一步染色。

● 可以對細(xì)胞進(jìn)行透化處理嗎？

不建議對細(xì)胞進(jìn)行透化處理，因?yàn)榻?jīng)Triton X-100或其它透化劑透化后，細(xì)胞內(nèi)將無熒光信號保留。

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