單線態(tài)氧檢測(cè)試劑盒是利用單線態(tài)氧特異性熒光探針單線態(tài)氧探針O22檢測(cè)單線態(tài)氧的試劑盒。單線態(tài)氧探針O22是合成的苯蒽類熒光探針,可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,與細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧反應(yīng),被氧化生成綠色熒光物質(zhì),綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧水平成正比,檢測(cè)綠色熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧的變化情況。...

單線態(tài)氧檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8787

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

探針-20℃避光保存,避免反復(fù)凍融；稀釋液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● 探針長(zhǎng)期不用可以-20℃保存,避免反復(fù)凍融。

● O22探針為DMSO溶液,冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

● 可以用手捂住使其溶解或37℃短時(shí)間水浴,吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

活性氧(ROS)包括過(guò)氧化氫(H2O2)、羥基自由基(?OH)、單線態(tài)氧(1O2)、一氧化氮(NO)、超氧陰離子(?O2-)、過(guò)氧化自由基(ROO?,Peroxyl radical)、過(guò)氧羥自由基(HOO?)及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)、ClO-和羥化物等,參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。

活性氧(ROS)的產(chǎn)生主要是氧化磷酸化的結(jié)果,在呼吸鏈中,在某些位點(diǎn)會(huì)有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應(yīng),在酶或非酶作用下引發(fā)一系列反應(yīng)生成不同種類的活性氧：“泄露”的電子最初和氧氣反應(yīng)生成超氧陰離子自由基(O2·-)。超氧陰離子遇水生成H2O2,同時(shí)過(guò)氧化氫也可由氧氣在單胺氧化酶(MAO)的作用下生成,生成的過(guò)氧化氫在髓過(guò)氧化物酶(MPO)的催化下與Cl-反應(yīng)可生成ClO-,在鐵或銅離子的催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)生成OH·,超氧陰離子遇氮氧化物反應(yīng)生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質(zhì)統(tǒng)稱為活性氧。

單線態(tài)氧檢測(cè)試劑盒是利用單線態(tài)氧特異性熒光探針單線態(tài)氧探針O22檢測(cè)單線態(tài)氧的試劑盒。單線態(tài)氧探針O22是合成的苯蒽類熒光探針,可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,與細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧反應(yīng),被氧化生成綠色熒光物質(zhì),綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧水平成正比,檢測(cè)綠色熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧的變化情況。

在激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng)526nm附近,使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)綠色熒光,從而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧水平。

單線態(tài)氧檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)；

● 背景低,靈敏度高；

● 線性范圍寬,使用方便。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀,激發(fā)波長(zhǎng)500±10nm,發(fā)射波長(zhǎng)530±10nm,或者按照FITC熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

● 離心機(jī) ● 移液器 ● PBS緩沖液(pH7.4,1×)● HBSS(含鈣鎂,不含酚紅)

使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 熒光探針標(biāo)記后,一定要洗凈殘余未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針,否則導(dǎo)致背景較高。

● 探針標(biāo)記完畢并洗凈殘余探針后,可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描,以確認(rèn)探針的標(biāo)記情況是否正常。

● 盡量縮短探針標(biāo)記后到測(cè)定所用的時(shí)間,以減少各種可能的誤差。

● 單線態(tài)氧O22在光照和空氣中易被氧化,注意避光密封保存。

● O22染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,并且在當(dāng)天用完。

● O22對(duì)濕度非常敏感,若是O22溶液每次取完需要量后,必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量,分裝密封保存。不可使用含水的吸頭。

● 對(duì)不同的細(xì)胞和組織,應(yīng)選擇合適的孵育時(shí)間和濃度,以觀察單線態(tài)氧的變化,很多細(xì)胞內(nèi)的單線態(tài)氧絕對(duì)水平較低,需要根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

● 單線態(tài)氧O22探針可以根據(jù)需要的用量分裝后凍存,避免反復(fù)凍融。

● 單線態(tài)氧O22不可一次性全稀釋后長(zhǎng)期保存,稀釋后穩(wěn)定性變差,有效期縮短。

● 單線態(tài)氧含量高則細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)。

● 以下操作步驟僅供參考，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際樣本情況調(diào)整或參考文獻(xiàn)?？梢杂脽晒饷笜?biāo)儀、共聚焦/顯微鏡等原位檢測(cè)，也可以收集后染色用流式細(xì)胞儀等檢測(cè)。

單線態(tài)氧檢測(cè)試劑盒使用方法：

單線態(tài)氧探針O22配制：

根據(jù)樣本數(shù)量計(jì)算需要的用量,用探針稀釋液5倍稀釋單線態(tài)氧O22探針后充分混勻,避光保存?zhèn)溆谩?稀釋后的單線態(tài)氧O22熒光探針最好在一個(gè)月內(nèi)用完,盡量避免反復(fù)凍融。

【注】：

● 可以不用試劑盒的稀釋液,直接用HBSS或不含血清的培養(yǎng)基稀釋。

● 不可以一次性將探針全部稀釋。

● 也可以不稀釋探針，直接在待檢測(cè)樣本中加入0.5-1μL探針（100μL體系），但是需要用好的移液器和吸頭，注意操作過(guò)程，保證探針有效的加入了樣品中，并充分混勻。

● 現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 沒(méi)用完的稀釋后的單線態(tài)氧O22熒光探針保存在4℃冰箱，最好在一周內(nèi)用完，盡量避免反復(fù)凍融。

單線態(tài)氧O22探針標(biāo)記：

單線態(tài)氧O22溶液可在新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基、HBSS緩沖鹽溶液或組織灌流液中稀釋到所需濃度,終濃度按試劑盒的母液的100-200倍稀釋,以此染色液更換細(xì)胞培養(yǎng)液或灌流液；也可直接向無(wú)血清細(xì)胞孵育液體或灌流液中加入單線態(tài)氧O22探針溶液至所需濃度。

原位標(biāo)記：僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。

1、按照1:100-200用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋單線態(tài)氧O22探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養(yǎng)基稀釋O22探針。

● 也可以用HBSS或PBS緩沖液稀釋探針。

● 如果是前面已經(jīng)5倍稀釋過(guò)的探針，此步再次進(jìn)行20-40倍稀釋，或者直接一次性100-200倍稀釋。

2、去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞一次。

【注】：

● 加入PBS再吸出。

3、加入適當(dāng)體積稀釋好的O22探針。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于96孔板每孔加入100-200μL染色液，6孔板一個(gè)孔加入稀釋好的O22探針不少于1mL。

4、在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20-60分鐘。

【注】：

● 若染色不夠充分，延長(zhǎng)染色時(shí)間。

● 依據(jù)細(xì)胞單線態(tài)氧含量的不同，單線態(tài)氧O22探針終濃度可以選擇在100-200倍稀釋的范圍，孵育時(shí)間可以選擇20分鐘-4小時(shí)，通常30分鐘左右即可。在37℃或室溫進(jìn)行避光孵育。

5、用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O22探針。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗滌細(xì)胞。

● 漂洗時(shí)間要短。

6、熒光酶標(biāo)儀/共聚焦/顯微鏡檢測(cè)。

收集后標(biāo)記：懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞消化處理

1、按照1:100-200用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋單線態(tài)氧O22探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養(yǎng)基稀釋O22探針。

● 也可以用HBSS或PBS緩沖液稀釋探針。

● 如果是前面已經(jīng)5倍稀釋過(guò)的探針，此步再次進(jìn)行20-40倍稀釋，或者直接一次性100-200倍稀釋。

2、離心移除培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞一次。

【注】：

● 500×離心5分鐘。

3、細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的O22探針中，細(xì)胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20-60分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。

【注】：

● 若染色不夠充分，延長(zhǎng)染色時(shí)間。

4、用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O22探針。

5、用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

【注】：

● 也可以用HBSS或PBS洗滌細(xì)胞。

6、流式細(xì)胞儀/顯微鏡檢測(cè)。

熒光顯微鏡觀察：

1、對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或活組織,可直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取25-50μL細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上,再蓋上一張蓋玻片。

2、熒光顯微鏡下觀察。

激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)526nm。

【注】：

● 單線態(tài)氧含量高則細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)。

流式細(xì)胞儀分析：

1、對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,直接收集細(xì)胞。染色并洗滌后用用0.5～1mL冰冷PBS重懸細(xì)胞(5～10萬(wàn))。

2、采用488nm波長(zhǎng)激發(fā),測(cè)定待測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

使用488nm激發(fā)波長(zhǎng),525nm發(fā)射波長(zhǎng),實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱變化情況。

【注】：

● 單線態(tài)氧含量高則細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)。

● 探針O22熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)探針O22產(chǎn)物。

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