Rho123可以快速通過(guò)細(xì)胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲，并且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有任何毒性。Rho123的最大激發(fā)波長(zhǎng)為507nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm。在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光。...

Rho123細(xì)胞膜電位檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR0416

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

RHO123染色液-20℃避光，避免反復(fù)凍融。10×染色緩沖液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● RHO123探針需要長(zhǎng)期保存時(shí)可以根據(jù)使用情況進(jìn)行小量分裝后-20℃保存。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

Rho123細(xì)胞膜電位檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(RHO123)是利用Rhodamine 123探針檢測(cè)線粒體膜電位變化的試劑盒，可以快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。Rho123是一種可以通透細(xì)胞膜的選擇性染色活細(xì)胞線粒體的熒光染料，廣泛用作檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)的熒光探針。Rho123是陽(yáng)離子熒光染料，在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)。在細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，引起線粒體跨膜電位(ΔΨm) 的崩潰，Rho123重新釋放出線粒體。通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化，可用于培養(yǎng)的細(xì)胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測(cè)。

Rho123可以快速通過(guò)細(xì)胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲，并且對(duì)細(xì)胞沒(méi)有任何毒性。Rho123的最大激發(fā)波長(zhǎng)為507nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm。在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光。

檢測(cè)方法：

● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類(lèi)型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 流式細(xì)胞儀/激光共聚焦/熒光顯微鏡 ● PBS或HBSS(無(wú)酚紅) ● 離心機(jī)

注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 始終保持平衡染液中pH 值的一致性，因?yàn)閜H 值的變化將影響膜電位。

● 根椐細(xì)胞種類(lèi)、實(shí)驗(yàn)條件不同流式細(xì)胞儀設(shè)置不同。

● 線粒體膜電位降低，熒光強(qiáng)度減弱。但是結(jié)果分析時(shí)注意排除熒光淬滅現(xiàn)象，Rho123熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜有一部分是重合的，其發(fā)射光有一部分(與激發(fā)光重合的部分)會(huì)被自己重新吸收，而且這種吸收的效益隨著該熒光物質(zhì)的濃度增加而增強(qiáng)。換而言之，當(dāng)熒光物質(zhì)濃度很高的時(shí)候其熒光強(qiáng)度和濃度的增加不成正比，此時(shí)注意檢測(cè)結(jié)果的分析。采用JC-1法可以減少熒光淬滅的影響。

Rho123細(xì)胞膜電位檢測(cè)試劑盒使用方法：

懸浮細(xì)胞：

1、試劑配制：

1×染色緩沖液配制：

根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制1×染色緩沖液，取100μL 10×染色緩沖液加900μL純水稀釋，混勻并預(yù)熱至37℃，即成1×染色緩沖液；

Rho123染色工作液的配制：

根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制Rho123染色工作液。在500μL 1×緩沖液中加入4μL Rho123，混勻配成Rho123 染色工作液。

2、收集樣本細(xì)胞以及陰性、陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞。

3、用PBS洗滌細(xì)胞兩次。離心收集細(xì)胞。

【注】：

● 300×g -500×g，2-8℃，離心時(shí)間5分鐘收集細(xì)胞。

4、用500μL Rho123染色工作液將細(xì)胞重懸，細(xì)胞密度約5-10×10⁵個(gè)/ml。37℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘。

5、常溫離心收集細(xì)胞。 用PBS 洗滌細(xì)胞1 次。

【注】：

● 300×g -500×g，離心時(shí)間5分鐘收集細(xì)胞。

6、用500μL預(yù)熱的1×染色緩沖液將細(xì)胞重懸。

7、用流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀/分光光度計(jì)檢測(cè)分析結(jié)果，或用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

貼壁細(xì)胞：

對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。

純化線粒體：

1、把配制好的RHO123染色工作液再用RHO123孵育緩沖液(1×)稀釋5倍。

2、0.9mL 5倍稀釋的RHO123染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg的純化的線粒體。

3、結(jié)果檢測(cè)。

組織樣本：

組織樣本可以用玻璃勻漿器勻漿成單細(xì)胞懸液后按照細(xì)胞樣本的方法檢測(cè)。也可以用其他細(xì)胞懸液制備的試劑盒處理組織后檢測(cè)。

結(jié)果分析：

檢測(cè)時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm。

線粒體膜電位降低，熒光強(qiáng)度減弱。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的情況。

也可用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察；用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 出現(xiàn)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照細(xì)胞的情況？

Rho123染色檢測(cè)線粒體膜電位時(shí)，理論上一般正常情況均是隨著細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位降低，熒光強(qiáng)度減弱。但是Rho123染料的特性決定不同的細(xì)胞類(lèi)型、染色方式、染液濃度、染色與處理的順序等因素都可以明顯影響Rho123的染色結(jié)果。其中影響最顯著的是細(xì)胞ΔΨm(Rho123的總攝入)、細(xì)胞質(zhì)膜的Pgp(P-糖蛋白)/MRP(多藥耐藥相關(guān)蛋白)(Rho123的胞內(nèi)保留)和Rho123的self-quenching等3個(gè)因素。

當(dāng)某些模型中質(zhì)膜Pgp 外排的影響或者線粒體中Rho123濃度很高導(dǎo)致的熒光self-quenching的影響超過(guò)了MMP 降低的影響時(shí)，會(huì)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞(膜電位降低細(xì)胞)的熒光強(qiáng)于對(duì)照細(xì)胞的現(xiàn)象，但此時(shí)胞內(nèi)的Rho123主要分布于胞漿中，而不是線粒體內(nèi)。

還有一些比較少見(jiàn)的情況是，有些模型的ΔΨm在細(xì)胞凋亡早期會(huì)有一過(guò)性升高，Rho123染色會(huì)一過(guò)性增強(qiáng)，如果檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)恰好重合，也會(huì)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照細(xì)胞的現(xiàn)象。

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