蛋白脫鹽柱是一種方便的蛋白脫鹽工具，只需離心操作即可用來對蛋白質(zhì)液體樣本進行脫鹽，還可用于蛋白質(zhì)、抗原、抗體、酶和微生物的濃縮純化。也可以用來對蛋白質(zhì)樣品中的鹽分、糖類、核酸、非水溶劑及其他一些低分子量物質(zhì)進行去除和緩沖液置換。還可以用來分離蛋白質(zhì)標記時未結(jié)合上的游離標記物。...

蛋白脫鹽柱

 

產(chǎn)品編號：HR0389

產(chǎn)品組成：

【注】：

● 脫鹽柱配有2個微量離心套管。

● 在操作過程中，一個可用于收集濾出液，而另一個用于回收脫鹽后的樣本。

儲存條件：

室溫避光保存。有效期1年。

【注】：

● 用過的脫鹽管要保持過濾膜濕潤，不能干掉。

產(chǎn)品簡介：

蛋白脫鹽柱是一種方便的蛋白脫鹽工具，只需離心操作即可用來對蛋白質(zhì)液體樣本進行脫鹽，還可用于蛋白質(zhì)、抗原、抗體、酶和微生物的濃縮純化。也可以用來對蛋白質(zhì)樣品中的鹽分、糖類、核酸、非水溶劑及其他一些低分子量物質(zhì)進行去除和緩沖液置換。還可以用來分離蛋白質(zhì)標記時未結(jié)合上的游離標記物。

蛋白脫鹽柱使用蛋白質(zhì)低吸附性的再生纖維素過濾膜制造，具有快速、方便、回收率高的特點，可替代并優(yōu)于透析法脫鹽及蛋白沉淀法蛋白濃縮。

蛋白脫鹽柱應(yīng)用場景：

1、脫鹽和緩沖液更換；

2、組織培養(yǎng)提取物或細胞裂解液中大分子組分的純化；

3、生物樣品濃縮：包括各種抗原、抗體、酶、核酸或微生物；

4、對稀釋或從柱洗脫液預先純化的蛋白質(zhì)進行濃縮。

產(chǎn)品特點：

1、高回收率 >90%；

2、垂直結(jié)構(gòu)的膜減少了濃差極化，加快離心速度，快達5分鐘；

3、熱密封膜將下游溶出物污染可能性降到最低；

4、100%完整性檢測確保性能可靠；

5、透明外殼和體積刻度方便樣品察看；

6、直接吸取樣品減少處理步驟；

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機。可容納1.5ml微量離心管的固定角度轉(zhuǎn)子離心機。 ● 振蕩器

● 移液器 ● 純水

典型蛋白質(zhì)脫鹽應(yīng)用實例：

產(chǎn)品規(guī)格參數(shù)：

初始樣本的最大體積：500μL

最終濃縮液的典型體積：15-20μL

建議的相對離心力：10,000×g(脫鹽離心)

1,000×g(反轉(zhuǎn)離心)

最大的相對離心力： 12,000×g

有效膜面積：1 cm²

截留體積：< 5μL

蛋白脫鹽柱尺寸：

過濾管和管子

長度(脫鹽模式；脫鹽管插在管中)：49.9 mm

長度(反轉(zhuǎn)離心；脫鹽管倒著插在管中)：47.4 mm

管(已蓋上蓋子)

直徑：10.8 mm；長度：42.1 mm

過濾脫鹽管

直徑：9.4 mm；長度：29.5 mm

脫鹽管材料：

過濾脫鹽管：苯乙烯共聚物/丁二烯

濾膜：低蛋白結(jié)合再生纖維素膜

收集管：聚丙烯

 

化學兼容性：

離心脫鹽管適用于生物液體和水溶液。

在使用前，請檢查樣本是否符合脫鹽管的化學相容性。

使用注意事項：

● 預實驗很重要。必須要做預實驗，在正式實驗之前取少量樣本優(yōu)化實驗條件，并像正式樣本一樣認真進行，看實驗結(jié)果是否可行，實驗條件是否適合自己的樣本。由于生物樣本的多樣性，不同樣本的實驗條件通常差異較大，同種細胞的不同模型下需要的實驗條件也可能不同，為了避免浪費正式樣本和試劑，一定要提前預實驗優(yōu)化實驗條件。

● 鹽分通過濾膜的過程不依賴樣品的濃度和體積，用過濾的方法來脫鹽并不改變緩沖液的組成，比如說，含有500 mM 鹽分的溶液在第一次離心后它的剩余液體鹽濃度并不發(fā)生改變，依然是500mM。再往脫鹽管中剩余溶液中加入水或無鹽緩沖液，再次離心，則會降低溶液中的鹽濃度。

● 這個過程我們將它稱為等體積過濾，反復多次地操作，可以使溶液鹽分降到最低。

● 如果我們想將樣品用不同組份緩沖液溶解，則我們可以使用等體積過濾達到目的。樣品脫鹽后，然后加入目的緩沖液，再進行反復的稀釋和脫鹽。

● 不同的蛋白脫鹽的速度不同，有的需要長時間離心，有的則很快就好。和蛋白樣品純度，所用buffer類型，蛋白的濃度有關(guān)系。離心時要先短些時間，觀察一下脫鹽速度；

● 如果需要多次重復使用，離心速度不要太高；

● 重復使用時要仔細檢查管壁上有沒有裂紋；

● 脫鹽柱濃縮蛋白會有蛋白損失，樣品體積大就分批離心，盡可能不要離心時間太長。

● 樣品里的雜質(zhì)如果可能盡量在離心前去除一些。

● 分子量小于5kD的溶質(zhì)可能只有部分被截留。2kD 的樣品截留率大約只有40%。過濾膜的截留率取決于溶質(zhì)的分子大小和形狀。目的蛋白小于5kD 的樣品不要使用脫鹽柱脫鹽。

● 濃縮液的樣本回收率低可能是由于吸附損失、過度濃縮，或樣本穿過濾膜而造成的。

● 吸附損失取決于溶質(zhì)濃度、疏水性、與過濾脫鹽管表面接觸的溫度和時間、樣本成分及pH。為了最大限度降低損失，離心后請立即回收脫鹽后的樣本。

● 如果樣本的起始濃度很高，請監(jiān)控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。

● 樣本有可能穿過濾膜，務(wù)必將每次的濾過液一直保留到脫鹽的樣品分析測試完成。

● 樣品蛋白最低起始濃度為25μg/ml。

● 加蛋白液或Buffer到脫鹽管時，可以用藍槍頭；但從脫鹽管底吸取脫鹽好的目的蛋白時，必須用黃槍頭；用槍頭伸入脫鹽管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 離心機轉(zhuǎn)速有相對離心力(RCF,×g)和每分鐘轉(zhuǎn)速(RPM)兩種表示方式,有些離心機設(shè)置有RPM和×g顯示切換,但部分離心機沒有自動切換功能。需要用下面的公式進行換算：

G=r×1.118×10^-5×rpm²(r為有效離心半徑,即從離心機軸心到離心收集管底部中心位置的長度,單位為厘米)例如：轉(zhuǎn)速為3000rpm,有效離心半徑為10cm,則相對離心力(RCF,×g)為=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2(×g)。

使用方法：

清洗脫鹽柱：

1、用緩沖液或純水進行預清洗。也可先用0.1 M NaOH 清洗，再用緩沖液或純水進行二次清洗。

2、離心管中的過濾膜一旦潤濕后應(yīng)避免變干。如果在預清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。

脫鹽操作步驟：

1、將內(nèi)管插入所提供的一個微量離心管中。

2、向內(nèi)管中加入不超過500μL的樣本，并蓋上蓋子。

【注】：

● 如果樣品體積小于過濾裝置的最大體積，則可以把它稀釋到最大體積后再離心，這有助于更有效地除去鹽分。

3、將蓋好蓋子的脫鹽管放入離心轉(zhuǎn)子中，讓蓋子的連接帶朝著轉(zhuǎn)子的中央；用一個類似的離心管平衡。

4、以2000-10000×g 離心約10-30分鐘。

【注】：

● 務(wù)必將濾過液一直保留到脫鹽的樣品分析測試完成。

● 影響流速的因素包括樣本濃度、起始體積、溶質(zhì)的化學性質(zhì)、相對離心力、離心轉(zhuǎn)子的角度、濾膜類型以及溫度。500μL 樣本的典型離心時間大約是10 至30 分鐘。盡管大部分樣本在離心開始后的前5 至10 分鐘發(fā)生過濾，但在離心10 至30 分鐘后才能達到最低的濃縮液體積(15-20μL)。

5、加入水或待更換緩沖液使樣品體積達到0.5 ml。

6、再次離心。

【注】：

● 務(wù)必將濾過液一直保留到脫鹽的樣品分析測試完成。

● 請將兩次的濾過液一直保留到脫鹽的樣品分析測試完成。

7、離心結(jié)束后將整個脫鹽管從離心機中取出，取出內(nèi)管。

8、為了回收脫鹽后的溶質(zhì)，將內(nèi)管倒過來插在另一個干凈的微量離心管中。放在離心機中，讓打開的蓋子朝著轉(zhuǎn)子的中央；用一個類似的離心管進行平衡。以1,000×g離心2分鐘，使脫鹽后的樣本從脫鹽內(nèi)管轉(zhuǎn)移到收集管中。濾液可以保存在收集管中。

【注】：

● 要達到理想的回收效果，請盡早進行倒置離心。

● 也可不倒置離心，直接用移液器直接吸出內(nèi)管中的樣品。

清洗和保存：

1、使用后用水沖洗干凈；

2、內(nèi)管加入超純水500μL，5000×g 離心5分鐘；

3、凈內(nèi)管中的水，加入500μL 0.1M NaOH，5000×g離心20分鐘；

4、用0.1M NaOH浸泡24小時；

5、用水沖洗干凈；

6、用無菌水浸泡2-8℃保存。

7、外管用自來水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。

【注】：

● 1個月不用的話，直接用100mM的NaOH保存！更長時間的話加0.02%疊氮鈉。

● 再次使用前，用純水充分沖洗干凈，然后在用樣品緩沖液平衡。

常見問題分析：

● 蛋白脫鹽柱會損失蛋白嗎？

分子量小于3000 Da的蛋白質(zhì)或多肽樣品會穿透過濾膜，不適合用本脫鹽柱進行脫鹽。3000-6000Da的蛋白質(zhì)會有少量損失。6000Da以上的蛋白質(zhì)損失很小。

● 膜會因為離心時間過長而變干么？

不會，因為脫鹽柱有死體積，總會有溶液殘留在濾管中。死體積大約10-20μL。

● 可以重復使用脫鹽柱么？

可以重復使用。如果使用、清洗、保存得當，可以反復使用多次。但是多次重復使用后過濾膜有破損風險，注意使用過程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過大。

● 蛋白在脫鹽時出現(xiàn)了沉淀，如何改進？

蛋白如果脫鹽過快或過度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白脫鹽后的最終濃度不超過20mg/ml。對于對脫鹽速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進方法是：

1)離心力降低30%-50%

2)在脫鹽過程中取出脫鹽管，用槍頭反復吹吸幾次。

● 脫鹽后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒有目的蛋白，可能的原因有哪些？

脫鹽管的蛋白最低起始濃度為25μg/ml。請確保樣本的起始濃度大于這個濃度。

如果問題仍然出現(xiàn)，請不要丟棄樣本濾過液以便用于分析可能的原因：

1）如果目的樣本在濾過液中，那么請排查：

a)使用的離心力是否是在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請換算成相應(yīng)的g 離心力，具體換算方法請垂詢。

b)離心機最近是否有校準過？

c)是否首次嘗試這個蛋白？如果能確保用同樣的脫鹽管對其它蛋白成功操作的話，那么有可能是這個目的蛋白的原因。有時蛋白會因其本身的一些特性(構(gòu)象差異)而影響脫鹽效果。

2)如果目的樣本也不在濾過液中，那么：

a)蛋白樣本起始濃度是否大于25μg/mL？

b)用來確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？

c)目的蛋白是不是沉淀了？

● 有時候用蛋白脫鹽離心管連水都離不下來，可能是什么原因？

如果出現(xiàn)這種情況，可能時過濾膜的孔被堵住。請先用0.1M NaOH 清洗再離心。

最后用緩沖液或純水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態(tài)，避免重新干燥。

● 推薦在室溫下進行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進行離心？

可以，但是低溫會增加蛋白樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長。

● 可以用于核苷酸純化與濃縮么？

可以

● 脫鹽柱可以用酒精消毒滅菌么？

脫鹽柱與70%乙醇是兼容的。

● 是否可以用于高壓滅菌？

不可以，脫鹽柱都是采用熱封設(shè)計，不可以用高壓高溫滅菌。

● 是否無熱源？

均非無熱源的

● 如何對蛋白脫鹽管進行去除內(nèi)毒素的處理？

提供的脫鹽管是沒有經(jīng)過去內(nèi)毒素處理的，同時由于內(nèi)毒素通常以多聚體的形式存在，大小在10-1000KD 之間不等，在脫鹽的過程中是無法去除的。可在實驗前通過先用0.5M NaOH 預清洗，隨后用純水/緩沖液buffer 清洗的步驟去除大部分內(nèi)毒素。

● 是否不含RNA酶？

我們不保證脫鹽柱不包含RNA酶，如果需要處理無Rnase樣品，建議您可以用0.1% DEPC在37℃浸泡 2 小時，以完全滅活RNA酶。殘留的DEPC可以用無酶超純水洗滌除去。

● 沒有液流流出，為什么？

可能是溶液比較粘稠或濃度太高；

● 蛋白柱去除去垢劑嗎？

去垢劑因其獨特的性質(zhì)，當濃度大于臨界微團濃度(Critical Micelle Concentration,CMC)時，去垢劑分子會聚集形成微團而改變分子構(gòu)象，這有可能會影響去污劑的去除效果。小于CMC值時可以去除。

● 如何判斷脫鹽管已經(jīng)失效？

在正常使用下，濾膜沒有被戳破時，脫鹽蛋白液中不含有蛋白或量很低(包括目的蛋白)，而第一次的濾下液中含有目的蛋白，則說明濾膜失效，需要換新的脫鹽管。

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