我公司的外泌體快速提取試劑盒系列產(chǎn)品，可以通過簡單離心快速高效獲得高純度外泌體顆粒。本試劑盒提取的外泌體完好無缺，能用于各種功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游應用實驗。...

高純度外泌體快速提取試劑盒(乳汁/唾液)

 

產(chǎn)品編號：HR8226

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

2-8℃保存，離心管室溫保存。有效期1年。

【注】：

● 離心管中的過濾膜一旦潤濕后應避免變干。如果在預清洗后不是立即使用，則讓液體保留在濾膜上，直到使用。

高純度外泌體快速提取試劑盒(乳汁/唾液)產(chǎn)品簡介：

總外泌體（Exosomes）提取試劑盒（乳汁/唾液用）適用于從各種乳汁/唾液樣品中提取總外泌體。不需要超速離心，僅需通過簡單的常規(guī)離心即可從樣本中獲取大量結構完整的外泌體，具有快速簡單，提取效率高的特點，可節(jié)省更多的實驗時間和樣本。提取的外泌體可根據(jù)實驗目的用于后續(xù)的多種實驗，應用范圍廣泛。

外泌體是活細胞分泌的來源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體 )的膜性小囊泡，直徑約為30-150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各種體液中，研究發(fā)現(xiàn)，Exosome內(nèi)含有與細胞來源相關的蛋白質、mRNA和microRNA，并且exosome能夠通過生物屏障，在細胞間傳遞功能性核酸分子，從而發(fā)揮各種生物學功能。

外泌體囊泡已經(jīng)成為細胞間通訊的重要介質，參與原核生物和高等真核生物細胞之間的生物信號傳遞，以調(diào)節(jié)不同范圍的生物過程。外泌體囊泡的病理生理作用開始在包括癌癥、感染性疾病和神經(jīng)變性疾病在內(nèi)的疾病中得到充分認識，顯現(xiàn)了外泌體作為疾病的早期診斷、治療干預的潛在新靶點的巨大應用前景。此外，未修飾和工程化的外泌體囊泡可能在大分子藥物遞送中具有應用價值。

傳統(tǒng)的乳汁/唾液中分離和提取exosome的主要方法是超速離心法，這種方法缺點是耗時耗力，往往需要30-70個小時，每次最多只能處理6個樣品，需要大量的起始材料，而且產(chǎn)量不高。

我公司的外泌體快速提取試劑盒系列產(chǎn)品，可以通過簡單離心快速高效獲得高純度外泌體顆粒。本試劑盒提取的外泌體完好無缺，能用于各種功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游應用實驗。

本試劑盒按每個樣本處理2mL乳汁/唾液計，每個50T試劑盒大約可以用于提取100mL乳汁/唾液。如果需要處理大量的乳汁/唾液，將提取液按說明書標準操作的體積等比例調(diào)整即可。

產(chǎn)品特點：

● 使用方便,無需超速離心,省時省力；

● 純度高,富集量大,應用范圍廣；

● 獲取的Exosome結構和功能完整；

● 穩(wěn)定性好,便于運輸,便于保存。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

●離心機 ●移液器 ●離心管 ●吸頭

使用注意事項：

● 以下以2mL乳汁/唾液為例，實際操作時按血清樣本和提取液用量體積比等比例調(diào)整使用即可。

● 不同乳汁/唾液樣本外泌體數(shù)量差異極大，請根據(jù)實際情況選擇乳汁/唾液樣本的量，根據(jù)下游應用和參考文獻確定。條件允許情況下采用盡可能多的乳汁/唾液樣本。

● 常規(guī)的乳汁/唾液樣本最佳上樣量為3-5mL及以上，條件允許的情況下采用盡可能多的乳汁/唾液樣本。

● 已經(jīng)分離好的外泌體樣本如果需要進行電鏡觀察，只能冰上或4℃保存，存放時間不超過兩天，注意不可冷凍保存，否則可能會影響電鏡觀察效果。

使用方法：

外泌體提取：

1. 收集2mL待提取的乳汁/唾液樣品，置2-8℃保存。

【注】：

● 凍存樣品解凍后置2-8℃保存。

● 最好使用新鮮樣本，冷凍樣品外泌體回收率會降低。

2. 將樣品在4℃條件下，3000×g離心15分鐘。棄沉淀，收集上清。

3. 小心將上清移入另一干凈離心管中。

4. 將樣品在4℃條件下，10000×g離心20分鐘。棄沉淀，收集上清。

5. 小心將上清移入另一干凈離心管中。

6. 在2mL乳汁/唾液樣品中加入2mL提取液A，蓋緊離心管蓋。

7. 輕輕上下顛倒混勻1分鐘左右，使液體充分混勻。制備成4mL待提取外泌體懸液（I）。然后進行下列外泌體純化步驟操作。

高純度外泌體快速提取試劑盒(乳汁/唾液)清洗外泌體純化離心管D(大)：

1. 用緩沖液或純水進行預清洗。

2. 離心管中的過濾膜一旦潤濕后應避免變干。如果在預清洗后不是立即使用,則讓液體保留在濾膜上,直到使用。

【注】：

● 可以在外泌體提取步驟中需要使用前再清洗。

● 重復使用時要仔細檢查管壁上有沒有裂紋。

外泌體純化：

1. 將外泌體純化離心管D(大)內(nèi)管插入所提供的一個配套離心管中。

2. 向內(nèi)管中加入過4mL的待提取外泌體懸液（I）樣本，并蓋上蓋子。

【注】：

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時,必須防止碰到濾膜,以免戳破濾膜。

● 加外泌體懸液或Buffer到內(nèi)管時,可以用藍吸頭(1mL)；但從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時,必須用黃吸頭(200μL)。

3. 將蓋好蓋子的外泌體純化離心管放入離心轉子中,用一個類似的離心管平衡。

【注】：

● 最好使用非固定角度的轉子。

● 使用固定角度轉子時,將白色膜片面朝上放置。

● 如果使用固定角轉子，最好適當減少待提取外泌體懸液體積，可以加至3.5mL。

4. 以4000×g 離心約10-15 分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過度濃縮。

● 如果外泌體樣本的起始濃度很高，請監(jiān)控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。第一次做新樣品時，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過液吸入帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到外泌體的樣品分析測試完成。

避免吸頭戳破濾膜導致外泌體損失。

● 影響流速的因素包括樣本濃度、相對離心力、離心轉子的角度以及溫度。常見樣本的典型離心時間大約是10至20分鐘。大部分樣本在離心開始后的前5至10分鐘發(fā)生過濾純化，但在離心10至20分鐘后才能達到最低的純化液體積（20μL）。

● 可以將濃縮的外泌體用PBS或HEPES等緩沖液（根據(jù)下游實驗需要選擇）稀釋，再次離心至大約剩余50μL-100μL，這樣的外泌體純度將再次提高，殘余的外源蛋白質和核酸更少。

5. 在50-100μL殘余液體中加入2mL外泌體提取液B。

6. 以4000×g離心約10-15分鐘。離心至大約剩余50μL-100μL液體。

【注】：

● 離心至大約剩余50μL-100μL液體即可，不要過度濃縮。

● 如果外泌體樣本的起始濃度很高，請監(jiān)控離心過程，以免樣本過度濃縮。過度濃縮會導致沉淀，這也可能帶來樣本損失。第一次做新樣品時，可以離心幾分鐘后觀察剩余液體大概體積。

● 建議將濾過液吸入帶蓋的離心管（自備）中保存，一直保留到外泌體的樣品分析測試完成。

避免吸頭戳破濾膜導致外泌體損失。

7. 離心結束后將整個離心管從離心機中取出，取出內(nèi)管。

【注】：

● 外泌體可能會有少量的吸附損失，吸附損失取決于外泌體濃度、與過濾純化內(nèi)管表面接觸的溫度和時間。為了最大限度降低損失，離心后請立即回收過濾后的外泌體樣本。

8. 為了回收純化后的外泌體，用200μL移液器插入純化管的底部，吸出純化后的50-100μL 純化外泌體懸液（II）。

【注】：

● 要達到理想的回收效果，請盡快吸出純化外泌體懸液。

● 從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時，必須用黃吸頭。

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 注意確保外泌體懸液完全吸出。

9. 套上外泌體純化離心管E（?。┑囊后w收集管，將純化外泌體懸液（II）吸入外泌體純化離心管E（小）的離心管（內(nèi)管）中，在4℃，11000-13000×g條件下離心10-15分鐘。

【注】：

● 外泌體純化離心管E（?。┲貜屠茫话阋粋€離心管可以用5-10次。

● 外泌體純化離心管E（?。﹥?nèi)管對外泌體沒有吸附，離心后可以直接重復使用。

● 如果需要清洗離心管，可以加入PBS用移液器吹打，吸掉PBS。再次加入新的PBS，在10000×g離心10 分鐘即可。

10. 吸取外泌體純化離心管E（?。┑氖占苤械囊后w，即得到外泌體樣品純品。

【注】：

● 可以根據(jù)下游實驗需要，用相應的緩沖液稀釋保存外泌體。

● 也可以用試劑盒中配的外泌體保存液稀釋保存外泌體。

● 也可直接用于外泌體蛋白提取。

● 將外泌體樣本-80℃保存或直接用于下游應用。

● 外泌體短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上長期不用時置-80℃保存。

● 保存前可以用0.22μm或0.35μm濾器過濾除菌。

11. 用純水或緩沖液洗滌兩種大小的內(nèi)管和收集管，繼續(xù)純化下一個樣品。

【注】：

● 洗滌內(nèi)管時，加入400μL PBS緩沖液或其它緩沖液，用吸頭反復吹打，吸掉緩沖液即可。

● 用PBS洗滌3-4次。

● 用吸頭伸入內(nèi)管中時，必須防止碰到濾膜，以免戳破濾膜。

● 每個離心管內(nèi)管建議重復使用5次，不要超過10次。

● 加外泌體懸液或Buffer到內(nèi)管時，可以用藍吸頭；但從內(nèi)管管底吸取純化好的外泌體時，必須用黃吸頭。

● 如果使用過的離心管需要長期保存，可以按下列方法清洗和保存離心管內(nèi)管。

外泌體純化離心管(大)清洗和保存：

1. 使用后用水沖洗干凈；

2. 內(nèi)管加入超純水4mL，4000×g離心5分鐘；

3. 吸凈內(nèi)管中的水，加入4mL 0.1M NaOH，4000×g離心20分鐘；

4. 用0.1M NaOH浸泡24小時；

5. 用水沖洗干凈；

6. 用無菌水浸泡2-8℃保存。

7. 外管用自來水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。

【注】：

● 1個月不用的話，直接用100mM的NaOH保存！更長時間的話加0.02%的疊氮鈉。

● 再次用前，用純水充分沖洗干凈，然后根據(jù)下游實驗需要，用相應的緩沖液平衡。

常見問題分析：

● 如何鑒定提取的外泌體？

通常使用透射電鏡檢測（形態(tài)）、粒徑檢測（大小）、外泌體標志蛋白Western blot檢測等方法鑒定提取的外泌體。

● 外泌體WB標志蛋白用什么？

在進行WB 檢測時，通常檢測外泌體標志蛋白為CD63、CD9、CD81、TSG101 、ALIX、HSP70等。

● 進行外泌體WB 鑒定時有什么內(nèi)參蛋白可供選擇？

沒有，該檢測屬于定性檢測。

● 蛋白濃度低？

很多細胞外泌體量不夠下游應用，在條件允許的情況請盡可能加大培養(yǎng)上清的上樣量。

處理部分樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。請選擇高質量的蛋白裂解液或蛋白提取試劑盒。

● 抽提得到的RNA濃度低？

很多細胞外泌體量不夠下游應用，在條件允許的情況請盡可能加大培養(yǎng)上清的上樣量。

● 外泌體純化管內(nèi)管膜會因為離心時間過長而變干么？

不會，因為內(nèi)管有死體積，總會有溶液殘留在內(nèi)管中。死體積大約10-20μL。

● 可以重復使用過濾管么？

可以重復使用。如果使用、清洗、保存得當，可以反復使用多次。但是超過8次重復使用后過濾膜有破損風險，注意使用過程中盡量避免尖銳物品戳到膜。離心力不要過大。

● 外泌體在純化時出現(xiàn)了沉淀，如何改進？

如果過濾過快或者過度濃縮都有可能引起沉淀。如果樣品的外泌體濃度很高，建議降低最終的外泌體濃度，保留更多的液體。

對于因過濾速度敏感而導致的沉淀，建議的改進方法是：

1）離心力降低30%-50%

2）在過濾過程中取出過濾管，用槍頭反復吹吸幾次。

● 有時候用外泌體純化離心管連水都離不下來，可能是什么原因？

如果出現(xiàn)這種情況，可能時過濾膜的孔被堵住。請先用0.1M NaOH清洗再離心。

最后用緩沖液或純水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態(tài)，避免重新干燥。

● 說明書中推薦在室溫下進行離心，考慮到外泌體的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進行離心？

可以，但是低溫可能會增加外泌體樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長。

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