細(xì)胞氧氣消耗檢測(cè)試劑盒可以用于直接,實(shí)時(shí)分析細(xì)胞呼吸和線粒體功能。本試劑盒可以用來(lái)測(cè)量各種全細(xì)胞（貼壁和懸浮細(xì)胞）,透化細(xì)胞,各種3D培養(yǎng)物,組織,小生物,球體,支架和基質(zhì)等。還適用于分離的線粒體,分離的酶,細(xì)菌,酵母和霉菌等的細(xì)胞外耗氧情況測(cè)量。...

細(xì)胞耗氧率檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8262

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

探針-20℃密封避光(避免反復(fù)凍融,防止氧化)；試劑B室溫保存。有效期6個(gè)月。

細(xì)胞耗氧率檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明：

本產(chǎn)品是利用我公司合成的特異性氧氣熒光探針R01來(lái)檢測(cè)細(xì)胞外耗氧情況變化的試劑盒?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的混合基于熒光酶標(biāo)儀便捷的直接進(jìn)行耗氧量測(cè)定。

R01耗氧量分析可實(shí)時(shí)測(cè)量全細(xì)胞或分離線粒體的耗氧量,是以高通量形式來(lái)評(píng)估用于代謝表征的細(xì)胞呼吸以及評(píng)估治療對(duì)線粒體功能毒性作用的一種可靠方法。

它可以使用熒光酶標(biāo)儀在標(biāo)準(zhǔn)微孔板上進(jìn)行有氧代謝的簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)測(cè)定。隨著呼吸作用的進(jìn)行,溶解氧被消耗,樣品中的氧氣濃度降低,導(dǎo)致R01分析的信號(hào)增加,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)耗氧量的測(cè)定。

R01是氧氣敏感的熒光探針,最大激發(fā)波長(zhǎng)為468nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為603nm。其熒光通過(guò)分子碰撞與氧氣反應(yīng),由O₂淬滅,在無(wú)氧條件下熒光強(qiáng)度更高,反之有氧條件下熒光強(qiáng)度變低,因此熒光信號(hào)的量與樣品中細(xì)胞外O₂的量成反比,從而R01可被用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞外氧氣消耗的變化。在測(cè)定中,耗氧量由熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化計(jì)算。細(xì)胞耗氧量增加,熒光信號(hào)的變化率增加；反之,耗氧量減少,熒光信號(hào)的變化率降低。

R01與O₂的這種反應(yīng)是非破壞性且完全可逆的,R01無(wú)細(xì)胞毒性,是化學(xué)穩(wěn)定的,惰性的,水溶性的和細(xì)胞不滲透的,不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜。因此還可同時(shí)與糖酵解,線粒體膜電位JC-1,ROS和細(xì)胞ATP、LDH等檢測(cè)的試劑結(jié)合使用,進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)。

用R01進(jìn)行細(xì)胞外耗氧檢測(cè)方法及其簡(jiǎn)單,不需要適用特殊的儀器設(shè)備,只需要熒光酶標(biāo)儀之類的熒光讀板設(shè)備即可。

細(xì)胞氧氣消耗檢測(cè)試劑盒可以用于直接,實(shí)時(shí)分析細(xì)胞呼吸和線粒體功能。本試劑盒可以用來(lái)測(cè)量各種全細(xì)胞（貼壁和懸浮細(xì)胞）,透化細(xì)胞,各種3D培養(yǎng)物,組織,小生物,球體,支架和基質(zhì)等。還適用于分離的線粒體,分離的酶,細(xì)菌,酵母和霉菌等的細(xì)胞外耗氧情況測(cè)量。

以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板計(jì),本試劑盒小包裝可以檢測(cè)200個(gè)樣本。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 廣泛適用于各種體外模型；不再局限于單層細(xì)胞,還能測(cè)定懸浮細(xì)胞、微生物和特定的3D培養(yǎng)物；

● 簡(jiǎn)單的“混合-檢測(cè)”方案允許使用多種其他分析試劑盒進(jìn)行多參數(shù)分析；

● 可逆轉(zhuǎn),能夠觀察耗氧量的瞬態(tài)和長(zhǎng)時(shí)間變化；

● 可適配多種熒光酶標(biāo)儀以及標(biāo)準(zhǔn)96孔和384孔；

● 以高通量的形式方便地測(cè)量；

● 無(wú)需等待專用設(shè)備空閑所需的實(shí)驗(yàn)室時(shí)間,也無(wú)需大額資金專用設(shè)備投入。

產(chǎn)品用途：

● 線粒體功能和細(xì)胞代謝研究；

● 測(cè)量活細(xì)胞中的線粒體活性；

● 研究各種處理對(duì)細(xì)胞耗氧量的影響；

● 研究基因修飾對(duì)細(xì)胞耗氧量的影響；

● 研究呼吸和線粒體功能；

● 探究氧含量與細(xì)胞代謝變化之間的聯(lián)系；

● 直接評(píng)估藥物處理的線粒體毒性。

適用樣本類型：

● 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞/懸浮細(xì)胞/透化細(xì)胞；

● 分離的線粒體；

● 3D培養(yǎng)物；組織；

● 分離的酶；

● 微生物：細(xì)菌/酵母/霉菌。

熒光檢測(cè)模式：

● 基礎(chǔ)模式：熒光強(qiáng)度測(cè)定；

● 標(biāo)準(zhǔn)模式：時(shí)間分辨熒光測(cè)量（TR-F）；

● 高級(jí)模式：熒光Lifetime calculation（FLIM,Autofluorescence Lifetime Imaging system,Dual-read Ratiometric TR-F measurement）

【注】：

● 以上取決于酶標(biāo)儀的類型和儀器設(shè)置,不是所有儀器可用。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光酶標(biāo)儀（須配備相應(yīng)的波長(zhǎng)過(guò)濾器和溫度控制器。時(shí)間分辨熒光功能的讀板機(jī)佳（如果有）） ● 離心機(jī) ● PBS/HBSS（無(wú)酚紅） ● 對(duì)照試劑（選配,非必須）：Glucose Oxidase,Antimycin A,FCCP ● 黑色透明底熒光專用培養(yǎng)板

細(xì)胞耗氧率檢測(cè)試劑盒使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量管裝試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 以下操作以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例。其他培養(yǎng)容器或裝置請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整試劑用量和檢測(cè)方法。各試劑等比例調(diào)整即可。O₂熒光探針終濃度25倍稀釋最佳。
● R01探針的信號(hào)變化直接取決于所測(cè)量細(xì)胞類型的細(xì)胞呼吸速率,建議盡可能使用每孔高的細(xì)胞密度作為起點(diǎn),并根據(jù)需要減少細(xì)胞數(shù)量。

● 并非所有細(xì)胞類型都消耗足夠用于檢測(cè)的氧氣。

● 必須用熒光培養(yǎng)專用的透明底黑色培養(yǎng)板,減少檢測(cè)時(shí)各孔之間的光互相干擾。

● 用于測(cè)定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預(yù)熱。

● 添加氧氣封閉液時(shí)注意避免產(chǎn)生氣泡。

● 盡可能使用多通道移液器添加試劑。

● 如果藥物有紅色熒光（如阿霉素等）需要換液,不含培養(yǎng)基和待測(cè)藥物,用HBSS貨PBS體系檢測(cè),在無(wú)血清無(wú)酚紅環(huán)境檢測(cè)。

● 建議設(shè)定FCCP處理的陽(yáng)性對(duì)照樣本。

關(guān)于儀器設(shè)置：

● 溫度對(duì)檢測(cè)有較大影響。有條件的話,務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀。

● 常規(guī)的熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量,使用基于單色儀或基于過(guò)濾器的酶標(biāo)儀,最佳激發(fā)波長(zhǎng)使用450-460nm,發(fā)射波長(zhǎng)使用586-600nm。可根據(jù)實(shí)際機(jī)器和樣本選擇信號(hào)最強(qiáng)的波長(zhǎng)。

● 具有檢測(cè)增益參數(shù)（PMT,Parameters）的通常設(shè)置為中或高。

● 使用bottom read讀數(shù)和top read讀數(shù)均可,基于不同的細(xì)胞模型,建議在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)兩種讀數(shù)模式均嘗試下,看哪種的趨勢(shì)更加明顯。

關(guān)于氧氣封閉液使用：

● 氧氣封閉液可以用移液器吸取添加,添加時(shí)需要沿著培養(yǎng)板壁慢慢加入,使其順板壁向下流到培養(yǎng)基表面。

● 也可以直接用滴瓶滴加,倒轉(zhuǎn)預(yù)熱的滴管瓶并輕輕施加壓力,使封閉液足以充注瓶尖。每個(gè)孔滴兩滴,使每個(gè)液滴在孔側(cè)面順應(yīng)向下流到培養(yǎng)基表面。

● 使用移液器添加封閉液時(shí),可將黃色吸頭的嘴部用鋒利的刀片或剪刀修剪處理。將豎直吸頭離尖端3-4mm 處45°角修剪處理。

● 取下滴管瓶?jī)?nèi)嘴蓋,輕輕吸取預(yù)熱的氧氣封閉液。避免上下吹吸形成氣泡。

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)：

● 對(duì)于貼壁細(xì)胞,在200μL培養(yǎng)基中的96孔板中接種細(xì)胞。在37℃的CO₂培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。

● 對(duì)于懸浮細(xì)胞,在檢測(cè)當(dāng)天在100μL培養(yǎng)基中接種。

● 注意所需的接種密度取決于細(xì)胞類型。 我們推薦進(jìn)行細(xì)胞接種密度預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳密度。通常從高細(xì)胞密度（通常為60,000）開(kāi)始,每孔的最佳細(xì)胞數(shù)一般為：貼壁細(xì)胞每孔80,000個(gè)細(xì)胞,懸浮細(xì)胞每孔5-6×10⁵（96 孔板）。

● 檢測(cè)待測(cè)樣品都設(shè)置3復(fù)孔。

● 注意始終每96孔板留出至少6個(gè)孔,以免添加細(xì)胞作為空白對(duì)照和信號(hào)控制孔。

關(guān)于對(duì)照孔設(shè)置：

● 一般空白孔要設(shè)置,其它對(duì)照根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。

● （推薦對(duì)照設(shè)置,以下可選,非必須）：

空白對(duì)照：	保留兩個(gè)或三個(gè)孔,使其不添加細(xì)胞以用作空白對(duì)照。 向每個(gè)孔中添加100μL新鮮培養(yǎng)基。 （不要在這些孔中添加R01氧熒光探針）
無(wú)細(xì)胞陰性對(duì)照：	使兩孔或三孔沒(méi)有細(xì)胞添加用作無(wú)細(xì)胞陰性對(duì)照。 加入100μL 新鮮培養(yǎng)基+ 4μL R01氧熒光探針。
無(wú)細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照：	使兩孔或三孔沒(méi)有細(xì)胞添加用作無(wú)細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照。 加入90μL新鮮培養(yǎng)基+ 10μL（1mg/mL）葡萄糖氧化酶（水溶液）+ 4μL R01氧熒光探針試劑。 如果讀板器設(shè)置正確,則這些孔將顯示出熒光強(qiáng)度/壽命的快速增加,這表明葡萄糖氧化酶活性引起的耗氧。
有細(xì)胞陰性對(duì)照：	向包含細(xì)胞的兩個(gè)或三個(gè)孔中加入1μL（100μM）抗霉素A儲(chǔ)備溶液+ 4μL R01氧熒光探針試劑。 抑制劑抗霉素A 將抑制由線粒體呼吸引起的氧氣消耗。
*有細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照：	向包含細(xì)胞的兩個(gè)或三個(gè)孔中加入1μL（0.1-5 mM）FCCP儲(chǔ)備溶液+ 4μL R01 氧熒光探針試劑。 激活劑FCCP將顯著提高細(xì)胞呼吸的氧氣消耗。 【注】： ● 如果使用FCCP處理,必須進(jìn)行劑量測(cè)試,因?yàn)榧?xì)胞對(duì)FCCP呈現(xiàn)鐘形響應(yīng)

使用方法：

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞模型。

【注】：

● 根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)相應(yīng)方案,準(zhǔn)備待測(cè)試化合物。

● 注意設(shè)置對(duì)照孔,復(fù)孔等。

● 建議始終使用至少兩個(gè)沒(méi)有細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照孔（不要在這些孔中添加R01氧熒光探針）和至少兩個(gè)其他無(wú)細(xì)胞的孔作為無(wú)細(xì)胞陰性對(duì)照孔。還可以考慮設(shè)置無(wú)細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照,如前“推薦對(duì)照”中所述。

2. 培養(yǎng)好的待檢測(cè)細(xì)胞移除培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞。

3. 加入100μL新鮮培養(yǎng)基。

【注】：

● 以96孔板為例。

4. 加入4μL R01氧熒光探針,充分混勻。

5. （可選）可以在此處添加待測(cè)試化合物（通常為1-10μL）（如果需要的話）。

【注】：

● 建議將添加的化合物的量保持在較低水平,以最大程度地減少溶劑的潛在影響。

6. 每孔加入100μL氧氣封閉液。

【注】：

● 建議用移液器準(zhǔn)確吸取,也可以直接用滴瓶滴加2滴。

● 需要沿著培養(yǎng)板壁慢慢加入,不要伸到培養(yǎng)基液面下快速加入。

● 注意避免產(chǎn)生氣泡。

● 封閉液量的微小變化（在90-110μL之間）對(duì)檢測(cè)沒(méi)有不利影響。

7. 然后用該細(xì)胞板進(jìn)行熒光細(xì)胞外O₂消耗變化情況檢測(cè)。

激發(fā)波長(zhǎng)455-468nm,發(fā)射波長(zhǎng)603nm。測(cè)定熒光強(qiáng)度,每2分鐘或3分鐘讀取一次。

【注】：

● 熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞外O₂消耗增加。

● 熒光檢測(cè)需要使用熒光專用的透明底黑色培養(yǎng)板。

● 有些細(xì)胞模型剛開(kāi)始檢測(cè)的一小段時(shí)間內(nèi)可能出現(xiàn)熒光強(qiáng)度下降的情況,一般10分鐘左右?？梢缘葻晒馄胶夂箝_(kāi)始上升的時(shí)間點(diǎn)作為起點(diǎn)。

8. 繪制耗氧率曲線。

【注】：

● 熒光強(qiáng)度值經(jīng)空白對(duì)照校正。

9. 計(jì)算每個(gè)樣品的斜率值。

【注】：

● 注意選擇每個(gè)信號(hào)曲線的線性部分,避開(kāi)起始的滯后數(shù)據(jù),避開(kāi)后期的平穩(wěn)期。

● 線性回歸確定每孔的斜率（OCR耗氧率）。

● 計(jì)算重復(fù)孔之間的平均值。

● （選做）如果需要,可以從所有測(cè)試值中減去無(wú)細(xì)胞陰性對(duì)照樣品或基于細(xì)胞的陰性對(duì)照樣品獲得的斜率。

結(jié)果示例：

1. 斜率曲線獲得

 

 

 

 

 

 

 

 

2. 繪制劑量反應(yīng)曲線

要生成劑量響應(yīng)曲線,繪制計(jì)算的耗氧率（OCR）與生成如上OCR曲線的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的化合物濃度的關(guān)系曲線,如下：OCR與藥物濃度的關(guān)系證明抗霉素A引起對(duì)細(xì)胞呼吸的抑制反應(yīng)。

 

 

 

 

 

 

 

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 耗氧率檢測(cè)趨勢(shì)跟預(yù)期的不一致？

檢查細(xì)胞接種和移液的一致性。

增加細(xì)胞密度。

將測(cè)定體積減少到60μL。

在某些較短檢測(cè)時(shí)間區(qū)間內(nèi),會(huì)出現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)的波動(dòng)情況,出現(xiàn)斜率下降或不變化,需要擴(kuò)大到更長(zhǎng)的時(shí)間范圍內(nèi)來(lái)分析耗氧率趨勢(shì)。一般檢測(cè)時(shí)間范圍不少于30分鐘。

溫度對(duì)檢測(cè)有較大影響。有條件的話,務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀,儀器以及所有培養(yǎng)基和儲(chǔ)備溶液均須使用前37℃預(yù)熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致,如果存在這種情況,請(qǐng)考慮將測(cè)定和平衡溫度降低到30℃,避開(kāi)外圈。

● 使用的細(xì)胞類型靈敏度不夠？

可以考慮以下改善方案：

增加酶標(biāo)儀的增益（PMT）設(shè)置。

在無(wú)酚紅或無(wú)血清的情況下測(cè)定。

增加R01氧熒光探針的體積（至少10μL/孔）。

減少R01氧熒光探針的體積（至2μL/孔）

增加細(xì)胞密度。

將測(cè)定體積減少到60μL。

測(cè)量底部讀數(shù)（如果有）。

調(diào)整TR-F焦距。

● 我無(wú)法在含有細(xì)胞的孔中檢測(cè)到任何信號(hào),或者我可以檢測(cè)到信號(hào),但斜率（速率）顯得很低？

檢查正確的儀器設(shè)置,設(shè)置信號(hào)優(yōu)化。

增加細(xì)胞密度。

將測(cè)定體積減少到60μL。

● 開(kāi)始測(cè)定時(shí)熒光強(qiáng)度出現(xiàn)下降趨勢(shì)？

有些細(xì)胞模型樣本剛開(kāi)始測(cè)定的一小段時(shí)間內(nèi)可能出現(xiàn)熒光強(qiáng)度下降的情況,一般10分鐘左右,可以等熒光平衡后開(kāi)始上升的時(shí)間點(diǎn)作為起點(diǎn)。

附 錄

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法

產(chǎn)品說(shuō)明：

細(xì)胞氧氣消耗檢測(cè)試劑盒是利用合成的特異性氧氣熒光探針R01來(lái)檢測(cè)細(xì)胞外耗氧情況變化的試劑盒。

R01是氧氣敏感的熒光探針,最大激發(fā)波長(zhǎng)為 468 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為603 nm。其熒光通過(guò)分子碰撞與氧氣反應(yīng),由O₂淬滅,在無(wú)氧條件下熒光強(qiáng)度更高,反之有氧條件下熒光強(qiáng)度變低,因此熒光信號(hào)的量與樣品中細(xì)胞外O₂的量成反比,從而R01可被用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞外氧氣消耗的變化。在測(cè)定中,耗氧量由熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化計(jì)算。

細(xì)胞活動(dòng)的代謝效應(yīng)可以通過(guò)分析R01熒光信號(hào)的變化率來(lái)評(píng)估,變化率低表明有氧代謝活動(dòng)減少,耗氧量減少；反之,變化率高表明有氧代謝活動(dòng)增加,細(xì)胞耗氧量增加。

應(yīng)用實(shí)例

一：細(xì)胞氧氣消耗率（OCR）的測(cè)定

二：藥物濃度與細(xì)胞耗氧率的量效關(guān)系測(cè)定

三：分離的線粒體的呼吸測(cè)定

四：耗氧率與線粒體膜電位（MMP）雙重分析

五：耗氧率與細(xì)胞活性雙重分析

應(yīng)用實(shí)例一：

細(xì)胞氧氣消耗率（OCR）的分析：

利用R01分析研究HepG2細(xì)胞的耗氧量。在用解偶聯(lián)劑FCCP處理的細(xì)胞中,由于呼吸作用增加,信號(hào)變化率也隨之增加。相反,用線粒體呼吸抑制劑抗霉素A處理則產(chǎn)生了相反的效果。由于耗氧量減少,信號(hào)變化率也降低。

這類測(cè)定可以在多種培養(yǎng)基中進(jìn)行,可以根據(jù)需要進(jìn)行靈活的實(shí)驗(yàn)分析設(shè)計(jì)。

材料和試劑：

● HepG2 細(xì)胞 ● FCCP ● Antimycin A ● 待測(cè)化合物 ● HBSS等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 培養(yǎng)HepG2細(xì)胞

2. 藥物處理細(xì)胞。

3. 測(cè)定熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖一（A）：

用調(diào)節(jié)線粒體功能的化合物處理后的細(xì)胞的R01典型熒光信號(hào)曲線：

抗霉素A（線粒體呼吸抑制劑）處理抑制了氧消耗,因此,探針信號(hào)變化率也隨之減小。使用FCCP（解偶聯(lián)劑）處理時(shí)耗氧量增加,探針信號(hào)變化率也隨之增加。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

細(xì)胞呼吸消耗溶解氧,降低了細(xì)胞外O₂含量,導(dǎo)致R01試劑熒光信號(hào)增加。增加的速率反映出了O₂消耗速率。抑制劑（Antimycin A）和藥物影響電子傳遞鏈,抑制了細(xì)胞呼吸,而解偶聯(lián)劑（FCCP）能促使呼吸作用達(dá)到最大速率。劑量響應(yīng)曲線顯示出良好的分析間重現(xiàn)性。

圖一（B）：相對(duì)細(xì)胞耗氧率：

以上的代謝效應(yīng)可以通過(guò)分析R01試劑信號(hào)的變化率來(lái)評(píng)估,變化率低表明有氧代謝活動(dòng)減少。經(jīng)調(diào)控耗氧率（OCR）的化合物處理后的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞代謝通量,以相對(duì)于未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞的百分比表示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實(shí)例二：

用于毒理學(xué)的R01解決方案,藥物濃度與細(xì)胞耗氧率的量效關(guān)系：

藥源性線粒體功能障礙與多種藥物類別有關(guān),并且研究證明其可顯著引起肝臟、心臟、腎臟、肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

得益于微孔板形式和分析性能,R01分析為藥源性線粒體影響的早期篩選以及生成劑量-響應(yīng)曲線提供了一種方便的解決方案（圖2）。這些研究可采用一系列相關(guān)的體外模型進(jìn)行,包括原代肝細(xì)胞和hiPSC衍生的心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞。

材料和試劑：

● 心肌細(xì)胞 ● Nifedipine ● HBSS等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 培養(yǎng)心肌細(xì)胞

2. 藥物處理細(xì)胞。

3. 測(cè)定熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖二：分析藥源性細(xì)胞毒性：

利用R01分析測(cè)定Nifedipine對(duì)心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞線粒體呼吸的劑量-響應(yīng)曲線。這些值由斜率OCR與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行歸一化處理得到。

 

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實(shí)例三：

測(cè)量分離的線粒體的呼吸：利用R01,能更容易地測(cè)量分離的線粒體的呼吸。該分析能夠在常規(guī)熒光酶標(biāo)儀上進(jìn)行,可基于微孔板直接進(jìn)行方便、高通量的電子傳遞鏈(ETC)活性評(píng)估(圖3A)。這有利于更方便地進(jìn)行化合物篩選和劑量-響應(yīng)分析（圖3B）。

此外,利用特定的底物和抑制劑組合,可以對(duì)單個(gè)ETC復(fù)合體和相關(guān)的線粒體蛋白進(jìn)行更詳細(xì)的機(jī)制評(píng)估。與傳統(tǒng)的極譜法相比,R01分析所需的樣品量相對(duì)較少,每次分離可以進(jìn)行更多的重復(fù)分析。低樣品量需求顯著增加了由單次線粒體處理可獲得的數(shù)據(jù)量,尤其是在使用 384 孔板時(shí)。

材料和試劑：

● 大鼠肝臟組織 ● 線粒體分離試劑盒 ● FCCP ● 待測(cè)化合物 ● HBSS等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 分離線粒體

2. 藥物處理線粒體。

3. 測(cè)定熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖三（A）：分析藥源性細(xì)胞毒性：

使用R01分析得到的分離線粒體（大鼠肝臟）的呼吸分析結(jié)果 (A) 顯示了用經(jīng)典的線粒體功能調(diào)節(jié)劑處理后的抑制和解偶聯(lián)作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

圖三（B）：分析藥源性細(xì)胞毒性：

使用大鼠肝臟線粒體篩選一組未知藥物以鑒定藥源性線粒體功能障礙（藥物2和6）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實(shí)例四：

線粒體功能的多參數(shù)和多重評(píng)估：

耗氧率（OCR）與線粒體膜電位（MMP）雙重分析：

通過(guò)將R01分析與其他相關(guān)酶標(biāo)儀兼容參數(shù)（例如,線粒體膜電位(MMP)、活性氧 (ROS) 或細(xì)胞ATP含量）的測(cè)定相結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞反應(yīng)的進(jìn)一步了解。這樣一來(lái),研究人員能夠更好地研究各種處理或條件變化對(duì)細(xì)胞功能的影響。它還有助于將觀察到的代謝干擾情境化,而無(wú)需進(jìn)行平行處理或使用不同的技術(shù)平臺(tái)。

在同一孔中進(jìn)行R01分析信號(hào)和JC-1測(cè)定。使用Antimycin A或FCCP處理HepG2細(xì)胞。兩種化合物均引起MMP降低(A),FCCP引起耗氧量的特征性增加,而Antimycin A則抑制呼吸(B)。

材料和試劑：

● HepG2細(xì)胞 ● JC-1線粒體膜電位試劑盒 ● FCCP ● Antimycin A ● HBSS等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 培養(yǎng)HepG2細(xì)胞

2. 藥物處理細(xì)胞。

3. 測(cè)定熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖四（A）：線粒體膜電位（MMP）

使用 JC-1 線粒體膜電位檢測(cè)FCCP 處理、Antimycin A 處理、未處理對(duì)照細(xì)胞的線粒體膜電位情況。使用FCCP 和Antimycin A處理的細(xì)胞均引起 MMP 降低。

 

 

 

 

 

 

 

圖四（B）：耗氧率（OCR）

使用R01分析FCCP處理、Antimycin A處理、未處理對(duì)照細(xì)胞的OCR。

使用FCCP處理的細(xì)胞OCR升高,使用Antimycin A處理的細(xì)胞OCR降低。

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實(shí)例五：

線粒體功能的多參數(shù)和多重評(píng)估：

耗氧率（OCR）與細(xì)胞活性（Calcein AM熒光法）雙重分析：

利用細(xì)胞活力（Calcein AM熒光法）和線粒體呼吸（OCR）的雙重測(cè)定,更好地理解

藥物治療對(duì)細(xì)胞功能的脫靶效應(yīng)（圖5）。

Antimycin A 處理（A）和Tamoxifen 處理（B）24 小時(shí)的 HepG2 細(xì)胞中的R01分析信號(hào)和Calcein AM雙重測(cè)定。兩種藥物都能減弱線粒體呼吸（淺紫紅色）。

Tamoxifen對(duì)細(xì)胞活力表現(xiàn)出顯著影響,而Antimycin A處理并未顯著降低細(xì)胞活力（深紫紅色）。這表明,Antimycin A對(duì)呼吸的影響是由更直接的線粒體機(jī)制引起的。

材料和試劑：

● HepG2細(xì)胞 ● 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒 ● Tamoxifen ● Antimycin A ● HBSS等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 培養(yǎng)HepG2細(xì)胞

2. 藥物處理細(xì)胞。

3. 測(cè)定熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖五（A）：抗霉素 A 處理

Antimycin A 處理的細(xì)胞OCR 明顯降低（●）,細(xì)胞活力未顯著降低（■）。

Antimycin A 對(duì)呼吸的影響是由直接的線粒體機(jī)制引起。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖五（B）：Tamoxifen 處理

Tamoxifen 處理的細(xì)胞OCR 明顯降低（●）,細(xì)胞活力明顯降低（■）。

Tamoxifen 對(duì)呼吸的影響不是由直接的線粒體機(jī)制引起。

 

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