CDCFDA的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)水解的精確動(dòng)力學(xué)與細(xì)胞功能有關(guān)，因此CDCFDA標(biāo)記可用于通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡監(jiān)測細(xì)胞。CDCFDA染料標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在細(xì)胞系之間差異很大，可能是由于細(xì)胞內(nèi)酯酶活性的差異導(dǎo)致。...

細(xì)胞質(zhì)染色試劑CDCFDA

 

產(chǎn)品編號：HR8632

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

染料長期不用可以-20℃避光保存。避免反復(fù)凍融。有效期6個(gè)月。

【注】：

● CDCFDA探針在2-8℃時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

細(xì)胞質(zhì)染色試劑CDCFDA產(chǎn)品簡介：

CDCFDA是一種帶有琥珀酰亞胺的熒光染料，可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，對活細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料。CDCFDA在結(jié)構(gòu)上將酚羥基部位改造成AM體，所以自身不發(fā)熒光，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CDCFDA的AM部位能被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成熒光產(chǎn)物，通過共價(jià)結(jié)合賴氨酸側(cè)鏈的氨基而摻入細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的蛋白，且結(jié)合后發(fā)出強(qiáng)的綠色熒光。CDCFDA的琥珀酰亞胺和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基部位結(jié)合，固定在細(xì)胞內(nèi)，不會(huì)漏出細(xì)胞外。

在細(xì)胞分裂增殖過程中，CDCFDA熒光強(qiáng)度會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而逐級遞減，標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半，根據(jù)這一特性，它可被用于檢測細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的估算及細(xì)胞分裂等方面。而且這種熒光產(chǎn)物能夠很好的保持，并且可以用乙醛固定，不會(huì)重新泄漏到胞外。

CDCFDA的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)水解的精確動(dòng)力學(xué)與細(xì)胞功能有關(guān)，因此CDCFDA標(biāo)記可用于通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡監(jiān)測細(xì)胞。CDCFDA染料標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在細(xì)胞系之間差異很大，可能是由于細(xì)胞內(nèi)酯酶活性的差異導(dǎo)致。

CDCFDA標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，優(yōu)于以前使用的其他細(xì)胞示蹤熒光探針如PKH26，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過程中，CDCFDA標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過流式細(xì)胞儀（FL1 通道）根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測出未分裂細(xì)胞，分裂一次（1/2的熒光強(qiáng)度），二次（1/4的熒光強(qiáng)度），三次（1/8的熒光強(qiáng)度），以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。CDCFDA可檢測分裂次數(shù)多達(dá)八次甚至更多。經(jīng)CDCFDA標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。CDCFDA的優(yōu)點(diǎn)在于染色更均勻，因此比起核酸染料，它在區(qū)分父子代細(xì)胞方面效率更高更準(zhǔn)確，比如利用流式細(xì)胞術(shù)，您可以輕易區(qū)分8-10代淋巴細(xì)胞。

CDCFDA標(biāo)記的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長達(dá)數(shù)周之久，它常被用來做活體細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)和用熒光電鏡觀察細(xì)胞長期活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。CDCFDA毒性小，不影響細(xì)胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患?？梢愿焖?，更準(zhǔn)確和更安全地得到想要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

CDCFDA標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。最常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測，也可以用于成纖維細(xì)胞、NK 細(xì)胞等其它細(xì)胞的增殖檢測。

CDCFDA標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，熒光波長：λex=496nm, λem=526nm。流式檢測時(shí)的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時(shí)的發(fā)射波長為526nm，使用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)可以采用FL1 detection channel。CDCFDA標(biāo)記的細(xì)胞除了流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖外，還可用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。。

細(xì)胞質(zhì)染色試劑CDCFDA檢測方法：

● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機(jī) ● PBS緩沖液 ● HBSS(無酚紅)

使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

● 染色濃度根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異。

● CDCFDA母液易水解，建議分裝保存，分裝后用封口膜密封管口，再用錫箔紙包裹，最后和干燥劑一起用塑料袋密封，≦-20℃冷凍保存。

● CDCFDA工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不能提前配制，因?yàn)镃DCFDA吸水會(huì)分解，影響染色效果。

● CDCFDA易被水解，在水溶液中會(huì)變質(zhì)。母液請?jiān)谑褂眠^程中避免接觸水。工作液在標(biāo)記細(xì)胞的過程中和水接觸是在許可的時(shí)間范圍內(nèi)的。

● CDCFDA溶解液在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以37℃水浴片刻至全部融解后使用。

● CDCFDA標(biāo)記細(xì)胞僅需5-15分鐘即可完成。對于不同細(xì)胞，最佳標(biāo)記時(shí)間需自行摸索。正式實(shí)驗(yàn)前，建議先做幾個(gè)孔摸索染色濃度和加入CDCFDA試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

● 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

● 以下染色步驟僅供參考。以實(shí)際需要使用。也可以原位染色。

使用方法：

1、根據(jù)需要檢測的細(xì)胞樣品數(shù)，用HBSS緩沖液將CDCFDA母液500-4000倍稀釋。

不同的細(xì)胞需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳染色濃度。如果熒光強(qiáng)度弱，可以適當(dāng)提高CDCFDA的終濃度。如果背景太高，可以適當(dāng)降低CDCFDA的終濃度，請摸索條件找到最佳濃度。

【注】：

● 也可以用PBS 等緩沖液或相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基稀釋染料母液至所需濃度。

● 開始實(shí)驗(yàn)前，使用HBSS 緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋CDCFDA到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度500-4000倍稀釋。

● 一般起始濃度按500-1000倍稀釋即可。

● 為了降低過度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和細(xì)胞毒性，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、將待測細(xì)胞用染色工作液重懸，至細(xì)胞濃度大約10⁷/mL。

【注】：

● 貼壁細(xì)胞也可原位染色。

3、在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育15-30分鐘。

4、離心后去上清，收集細(xì)胞，用PBS或無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，最后加入PBS或無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

5、取500μL細(xì)胞懸液，用激光共聚焦/流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為526 nm。

可以在熒光顯微鏡下直接觀察標(biāo)記效果，也可以在培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后再用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞，或用于其他特定實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡募?xì)胞熒光示蹤。標(biāo)記的細(xì)胞也可以用于活體動(dòng)物的移植，并用熒光進(jìn)行示蹤。標(biāo)記的細(xì)胞呈綠色熒光。

6、隨后還可按照細(xì)胞的正常培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

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