本試劑盒可以方便快捷的檢測凋亡細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。...

Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR8285

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

染色液2-8℃避光保存；結(jié)合液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● Annexin V-APC染色液長期不用-20℃保存,避免反復(fù)凍融,凍融會導(dǎo)致失效。

● Annexin V-APC染色液需長期保存時,可根據(jù)用量進(jìn)行分裝后-20℃保存。

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒將Annexin Ⅴ與7-AAD匹配使用,可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。壞死細(xì)胞可以同時與Annexin V-APC和7-AAD結(jié)合顯色,而7-AAD則被排除在活細(xì)胞(APC陰性)和早期凋亡細(xì)胞(APC陽性)之外。在沒有巨噬細(xì)胞的情況下,凋亡的最后階段會像細(xì)胞壞死一樣發(fā)生整個細(xì)胞的解體,從而使凋亡晚期的細(xì)胞也同時被APC和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。

本試劑盒可以方便快捷的檢測凋亡細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 方便：可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測；

● 快速：1小時內(nèi)即可完成實驗；

● 準(zhǔn)確：能準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞,并計數(shù)各群細(xì)胞的比例。

檢測方法：

● 流式細(xì)胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

●流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 ●離心機(jī) ●移液器 ●PBS或者HBSS

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體損失導(dǎo)致試劑量不夠用。

● 細(xì)胞處理需小心操作,盡量避免人為損傷細(xì)胞。離心力在不損失細(xì)胞的前提下盡可能小,重懸細(xì)胞是動作要輕柔,避免多次反復(fù)的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。

● Annexin V-APC和7-AAD是光敏物質(zhì),在操作時請注意避光,盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。

● 由于細(xì)胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程,因此最好在染色后立即進(jìn)行分析。

● 使用Annexin V-APC試劑盒檢測凋亡需要針對活細(xì)胞。不要固定細(xì)胞,固定操作會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

● 如果細(xì)胞樣品中含有血小板,如血液樣品,請使用含有EDTA的緩沖劑并200g 離心洗去血小板。因為血小板含有PS,能與Annexin V結(jié)合。

● 流式細(xì)胞儀檢測時,細(xì)胞數(shù)量應(yīng)不低于1×10⁵。

● 如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶,需注意用PBS洗凈去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-APC,最終導(dǎo)致染色失敗。

● 貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡時如有漂浮細(xì)胞,需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。中晚期凋亡細(xì)胞失去貼壁能力而漂浮于培養(yǎng)基,此部分細(xì)胞對結(jié)果有顯著影響,不可隨意丟棄,需離心后收集與貼壁細(xì)胞一起檢測,才能全面的反映出細(xì)胞凋亡的整體情況；

● 對于貼壁細(xì)胞,消化是個關(guān)鍵步驟。處理貼壁細(xì)胞時要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞,胰酶消化時間過短,細(xì)胞需要用力吹打才能脫落,容易造成細(xì)胞膜的損傷,7-AAD攝入過多；消化時間過長,細(xì)胞膜同樣易造成損傷,甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-APC的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后,輕搖使胰酶與細(xì)胞充分接觸,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段時間,待細(xì)胞間空隙增大,瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中應(yīng)不用EDTA,EDTA影響Annexin V與PS的結(jié)合。

● 成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響,如細(xì)胞類型、細(xì)胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時PS 翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時間以及實驗過程中機(jī)械損傷的程度等,把這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化對實驗成功與否至關(guān)重要。務(wù)必根據(jù)每次實驗樣本類型和操作流程對這些步驟進(jìn)行優(yōu)化。

● 在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測之前,事先進(jìn)行顯微鏡觀察有好處。

● 有極少數(shù)細(xì)胞株其細(xì)胞膜上PS密度很低,難以染色,此時不適合用Annexin V 方法檢測凋亡。

使用方法：

樣品染色：

1、離心收集懸浮細(xì)胞。離心機(jī)300-500g力,2-8℃,離心時間5分鐘,棄培養(yǎng)基。

【注】：

● 對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下所有的貼壁細(xì)胞,并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。

● 貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后離心,收集細(xì)胞。胰酶消化時間不宜過長,以防損傷細(xì)胞膜,引起假陽性。

● 檢測貼壁細(xì)胞時,胰酶消化前,去掉的上清也要保留,因為可能存在一些掉下來的凋亡細(xì)胞,在胰酶消化后,再將這些上清加回去,一起離心后收集檢測,結(jié)果更加準(zhǔn)確。

● 對于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法完全離心至離心管底,可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。

● 離心轉(zhuǎn)速根據(jù)平時該細(xì)胞實驗時的轉(zhuǎn)速即可。

● 離心后小心吸除上清,可以殘留約50μL左右的液體,以避免吸走細(xì)胞。加入約1mL 4℃預(yù)冷的PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清。

2、用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。(300g-400g,2-8℃,離心時間5分鐘收集細(xì)胞)。

3、用100μL 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞,濃度大約為1-5×10⁶cells/mL。

4、在細(xì)胞懸浮液中加入5μL Annexin V-APC染色液,輕輕混勻后于2-8℃避光條件下孵育5-10分鐘。

5、加入5μL 7-AAD染色液后輕輕混勻于2-8℃ 避光條件下孵育1-3分鐘。

6、加入400μL PBS或1×Annexin V結(jié)合液,輕輕混勻。

7、立即用流式細(xì)胞儀檢測。

【注】：

● 染色完成后要盡快上機(jī)檢測,因為細(xì)胞在Annexin V結(jié)合緩沖液中存活時間不會太長。

Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒流式細(xì)胞儀分析：

經(jīng)處理過的細(xì)胞此時可以在流式細(xì)胞儀上分析。按常規(guī)流式凋亡檢測操作即可。

Annexin V-APC的熒光最大激發(fā)波長652nm,最大發(fā)射波長670nm；7-AAD 熒光最大激發(fā)波長550nm,最大發(fā)射波長在647nm。

上機(jī)檢測前,須用待測細(xì)胞制備質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償和設(shè)置十字門的范圍：

(I)未轉(zhuǎn)染GFP等標(biāo)記的細(xì)胞

① 空白管：陰性對照組細(xì)胞,沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于調(diào)節(jié)電壓。

② 單染管：有明顯凋亡的細(xì)胞,只加Annexin V/APC染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

③ 單染管：有明顯凋亡的細(xì)胞,只加7-AAD染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償

④ 檢測管：待測的處理細(xì)胞,加Annexin V/APC,7-AAD。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后,獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

(II)轉(zhuǎn)染GFP細(xì)胞

① 未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,陰性對照組細(xì)胞,沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于調(diào)節(jié)電壓。

② 轉(zhuǎn)染GFP空白管：轉(zhuǎn)染GFP的對照組細(xì)胞,沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC,7-AAD。用于調(diào)補(bǔ)償。

③ 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞,只加Annexin V/APC染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

④ 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞,只加7-AAD染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

⑤ 檢測管：待測的處理細(xì)胞,加Annexin V/APC,7-AAD。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后,獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

【注】：

● 具體流式設(shè)置按常規(guī)方法即可。參照流式細(xì)胞儀說明書或咨詢儀器技術(shù)支持。

常見問題分析：

實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。

● 確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡?？赏ㄟ^設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽性藥物對照來排除這一情況。

● 貼壁細(xì)胞消化不當(dāng)。Annexin V跟PS的結(jié)合需要Ca²⁺離子,結(jié)合液中含有Ca²⁺,

EDTA的消化會影響染色,建議使用無EDTA的胰酶,或者消化后用PBS洗滌干凈。

● 細(xì)胞離心用冷PBS 洗滌后,應(yīng)盡量吸干殘余液體,殘余過多的PBS 中含有磷酸根,會形成磷酸鈣沉淀,影響Annexin V的染色。

● Annexin V結(jié)合液瓶蓋要蓋緊密封,長時間暴露于空氣后,空氣中的CO₂進(jìn)入后形成CaCO₃會產(chǎn)生沉淀,從而減少游離的Ca²⁺,導(dǎo)致實驗的結(jié)果不佳。

● 污染其他的緩沖液。如吸取PBS 后不更換Tip頭會導(dǎo)致游離的Ca²⁺的減少,從而導(dǎo)致實驗的結(jié)果不佳。

● 陽性細(xì)胞的丟失。如果是貼壁細(xì)胞,藥物誘導(dǎo)后漂浮的細(xì)胞要收集起來合并檢測,這部分細(xì)胞往往是凋亡陽性的細(xì)胞,丟棄會造成陽性結(jié)果偏低。

實驗過程中陽性率偏高。

● 細(xì)胞本身活力太差。實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對照細(xì)胞經(jīng)染色后AnnexinV+/7-AAD+雙陽性的細(xì)胞比例過高,造成這種結(jié)果的原因可能是細(xì)胞本身活力太差。建議用臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞的活力,臺盼藍(lán)拒染的細(xì)胞應(yīng)大于95%。若活力偏低低,建議重新復(fù)蘇細(xì)胞,通常剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代3次

以后才能進(jìn)行實驗。

● 細(xì)胞操作不當(dāng)。貼壁細(xì)胞消化過程中反復(fù)劇烈吹打?qū)е录?xì)胞膜破壞,使得假陽性偏高。細(xì)胞洗滌、重懸等過程過于劇烈導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。Annexin V-APC會進(jìn)入損傷的細(xì)胞膜,在細(xì)胞膜內(nèi)部染色。

● 凋亡誘導(dǎo)時間過長。一般情況下誘導(dǎo)幾個小時就可以出現(xiàn)早期凋亡,因此通常不需要處理大于48小時以上,誘導(dǎo)時間過長會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡,導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差,假陽性結(jié)果偏高。

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