本產(chǎn)品是采用N01/PI雙染法染色活細(xì)菌和死細(xì)菌。本試劑盒中的N01活細(xì)菌核酸染色探針為綠色熒光標(biāo)記的活細(xì)菌探針，具有500/525nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。...

活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8597

試劑盒組成：

保存條件：

染色液A -20℃避光保存；染色液B 2-8℃避光保存，避免反復(fù)凍融。有效期1年。

【注】：

● 染料長(zhǎng)期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是采用N01/PI雙染法染色活細(xì)菌和死細(xì)菌。本試劑盒中的N01活細(xì)菌核酸染色探針為綠色熒光標(biāo)記的活細(xì)菌探針，具有500/525nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)。

當(dāng)膜通透性的綠色熒光探針N01進(jìn)入細(xì)菌后，選擇性的跟DNA結(jié)合。染色探針N01在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光較弱，當(dāng)與DNA結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，被激發(fā)后可以發(fā)出綠色的熒光，具有很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。

紅色核染色染PI不能穿過(guò)活細(xì)菌的細(xì)胞膜，它僅穿過(guò)死細(xì)胞膜的無(wú)序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(激發(fā)：488，545nm，發(fā)射：617 nm)，因此PI僅對(duì)死細(xì)胞染色。

由于N01-DNA和PI-DNA都可被488nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。根據(jù)以上特點(diǎn)，N01和PI可以被結(jié)合用來(lái)作為活細(xì)菌和死細(xì)菌的雙重染色。

本試劑盒是利用活死細(xì)菌的膜通透性改變進(jìn)行的檢測(cè)，適用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀。本測(cè)定原理適用于大多數(shù)細(xì)菌類型，包括各種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌。細(xì)菌活力的常見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力生長(zhǎng)測(cè)定，使用本試劑盒產(chǎn)生的結(jié)果與液體或固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)檢測(cè)相關(guān)性良好。但是需要注意，不同于動(dòng)物細(xì)胞，在一定的條件下，具有損傷膜的細(xì)菌可能能夠恢復(fù)和繁殖，這種細(xì)菌可以在本試劑盒的測(cè)定中被檢測(cè)為“死亡”。相反，一些膜完整的細(xì)菌可能無(wú)法在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖，然而這些細(xì)菌可能被記為在這個(gè)測(cè)定中被檢測(cè)為“活著”。如果在該測(cè)定法和細(xì)菌之間觀察到相當(dāng)大的差異，應(yīng)該考慮這些可能性。

以每個(gè)樣本100μL染色液計(jì)，本試劑盒小包裝可以染色500個(gè)樣本。

熒光探針N01除了最簡(jiǎn)單的細(xì)菌核熒光標(biāo)記外，還可以用于熒光成像，微孔板分析和流式細(xì)胞術(shù)。在合適的濾光器下，這種DNA結(jié)合染料與其他顏色的熒光染料一起可用于活細(xì)菌的多種顏色分析。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/熒光酶標(biāo)儀/熒光分光光度計(jì)/激光共聚焦/流式細(xì)胞儀等

● 離心機(jī) ● 移液器 ● 0.85% NaCl溶液

使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。融解后離心至管底部再打開(kāi)螺旋蓋。

● 試劑A為了便于觀察防止誤操作導(dǎo)致?lián)p失，在試劑盒中時(shí)是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。

● 建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)N01母液進(jìn)行小量分裝，每次使用一管，試劑-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

● 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 所有染色液操作在塑料容器進(jìn)行，不要在玻璃容器染色。

● 以下為進(jìn)行活死細(xì)菌染色觀察的參考步驟，可以根據(jù)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行調(diào)整。如果有必要，也可以設(shè)定對(duì)照活細(xì)菌和死細(xì)菌，進(jìn)行定量檢測(cè)。可以可以根據(jù)需要自己設(shè)定對(duì)照和檢測(cè)方法。

● 標(biāo)記的條件因細(xì)菌種類而異，根據(jù)不同樣本的實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求、細(xì)菌類型、細(xì)菌的膜通透性等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。

● 流式檢測(cè)時(shí)建議添加直徑6.0μm微球標(biāo)準(zhǔn)品。

● 細(xì)菌類型會(huì)明顯影響紅色熒光的量。

關(guān)于細(xì)菌死/活的定義標(biāo)準(zhǔn)：

● 需要注意任何單一指標(biāo)判斷細(xì)菌死活的局限性。就單個(gè)細(xì)菌樣本的生理狀態(tài)而言，并不容易定義生存能力或形態(tài)參數(shù)，因此進(jìn)行單個(gè)指標(biāo)的生存力測(cè)定可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)中引入特定的偏見(jiàn)。

● 本產(chǎn)品的這種LIVE/DEAD細(xì)菌膜通透性染色測(cè)定與在合適的液體或固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)分析的其他細(xì)菌生存力的標(biāo)準(zhǔn)一般需要結(jié)合分析。在某些情況下，細(xì)菌膜受損可能會(huì)恢復(fù)和繁殖，即使此類細(xì)菌在本產(chǎn)品分析中可能被評(píng)為“死亡”。相反，某些具有完整膜的細(xì)菌可能無(wú)法在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖，但在本產(chǎn)品分析中被評(píng)為“活”。

● 幾種不同生存能力衡量指標(biāo)，例如膜滲透性，酶活性和氧化還原電位需綜合分析評(píng)判，才可能提供更多徹底評(píng)估細(xì)菌生存力并清除固有任何單一生存力測(cè)定法的局限性。

活細(xì)菌/死細(xì)菌雙染試劑盒關(guān)于染色條件的優(yōu)化：

● 不同的細(xì)菌類型會(huì)明顯影響熒光的量。

● 建議的染色條件染色以下細(xì)菌類型顯示出良好的相關(guān)性，其它細(xì)菌類型請(qǐng)?jiān)谝韵路秶虺^(guò)以下濃度范圍內(nèi)測(cè)試最佳染色條件：Bacillus cereus,B. subtilis,Clostridium perfringens,Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,Micrococcus luteus,Mycobacterium phlei, Pseudomonas aeruginosa,P.syringae,Salmonella oranienburg,Serratia marcescens,Shigella sonnei,Staphylococcus aureus,Streptococcus pyogenes,Agrobacterium tumefaciens,Edwardsiella ictaluri,Eurioplasma eurilytica,Lactobacillus sp.,Mycoplasma hominus,Propionibacterium sp.,Proteus mirabilis and Zymomonas sp.。

● 標(biāo)記條件因細(xì)菌種類而異，根據(jù)不同樣本實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求、細(xì)菌類型、細(xì)菌的膜通透性等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳條件。

使用方法：

根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制染色工作液。

用37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱0.85% NaCl溶液將N01熒光染料進(jìn)行500倍稀釋，將PI進(jìn)行100-500倍稀釋，配制成染色工作液。

例如：

每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20μL染色液A，充分混勻，即成染色工作液A。

每10ml 0.85% NaCl溶液中加入20-100μL染色液B，充分混勻，即成染色工作液B。。

【注】：

● 由于不同細(xì)菌的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定N01和PI的最適濃度。梯度篩選原則為使用最低探針濃度得到最好的熒光結(jié)果。為了降低探針加載過(guò)度可能引起的假陽(yáng)性，建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用0.85% NaCl溶液稀釋染料儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。工作濃度應(yīng)根據(jù)不同細(xì)菌的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度，建議至少在超過(guò)10倍范圍的濃度下進(jìn)行測(cè)試。

● 一般N01染色終濃度為試劑盒中染料母液的500倍稀釋適合大多數(shù)細(xì)菌樣本。極個(gè)別細(xì)菌樣本可能需要提高染色濃度至200倍稀釋。

● PI的使用終濃度為染料母液的100-1000倍稀釋，150-300倍適合大多數(shù)細(xì)菌樣本。

● N01和PI可以混合在一起染色，也可以分開(kāi)進(jìn)行染色。初次實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好分開(kāi)染色。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，能確定兩種染料的最佳濃度后可以混合在一起染色。

● 兩種染料的比例根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整，如果綠色過(guò)于突出，可以降低N01的濃度或者稍微提高PI的濃度；如果紅色過(guò)于突出，則增加N01的用量或降低PI的用量。

● 注意PI的濃度在染上色的前提下盡可能低，否則可能有細(xì)胞毒性，使原本的活細(xì)胞染上色。

● 確定了染色終濃度以后，可以將染色液配制成100×的工作液，使用時(shí)按每100 μL細(xì)菌懸液中加入1μL染色液，充分混勻后染色。

細(xì)菌染色：

1. 收集樣本細(xì)菌，用0.85% NaCl溶液洗滌細(xì)胞3次。

【注】：

● 必須充分洗滌以去除培養(yǎng)基，殘余的培養(yǎng)基會(huì)影響染色效果。

● 不要用PBS等磷酸鹽緩沖液洗滌，會(huì)影響染色效果。

● 一般10000×g下離心10-15分鐘沉淀細(xì)胞。

2. 用100μL-200μL染色工作液將細(xì)菌重懸。

【注】：

● 也可先用0.85% NaCl溶液制備細(xì)胞懸液，然后按比例加入100×的染色工作液。

● 初次實(shí)驗(yàn)時(shí)兩種染料分別染色。

3. 在室溫避光孵育15分鐘。

4. 用0.85% NaCl溶液洗滌細(xì)菌一次。

5. 用適量0.85% NaCl溶液重懸細(xì)菌。

6. 將5μL菌液滴加到載玻片，蓋上蓋玻片，油鏡觀察。

7. 用熒光顯微鏡觀察。激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為525nm 和617nm。

【注】：

● 在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，如果背景高，可以再次清洗掉細(xì)胞外的染料后再觀察。

結(jié)果分析 ：

可以在Ex/Em = 488/525nm（FITC濾光器組）和540/620nm（TRITC濾光器組）下熒光測(cè)量染色細(xì)胞，分別用于活細(xì)菌和死細(xì)菌。

熒光顯微鏡下，使用490±10nm波長(zhǎng)激發(fā)，活細(xì)菌為黃綠色，死細(xì)菌為紅色。

用545nm波長(zhǎng)激發(fā)，僅能夠看到紅色的死細(xì)菌。

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