5′末端同位素標(biāo)記試劑盒是高品質(zhì)的探針標(biāo)記及檢測產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，5′末端同位素標(biāo)記試劑盒是我司眾多優(yōu)質(zhì)探針標(biāo)記及檢測之一，質(zhì)量堪比同類進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括5′末端同位素標(biāo)記試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：5′末端同位素標(biāo)記試劑盒
英文名稱：DNA 5′End-Labeling Kit
產(chǎn)品貨號：BTN131036
產(chǎn)品規(guī)格：20次

本產(chǎn)品為DNA 5′末端標(biāo)記系統(tǒng)，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。原理如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5′末端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸化處理，因?yàn)槭褂玫膋inase 能使5′末端的磷酸與[γ-32P]ATP的γ-磷酸進(jìn)行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的5′末端游離的OH基團(tuán)都能通過Kinase反應(yīng)被標(biāo)記(或者只是簡單的磷酸化)。
3. 提供的兩種反應(yīng)液使交換反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)都能進(jìn)行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

試劑盒組份：

成分	規(guī)格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交換反應(yīng)緩沖液	100μl
10×磷酸緩沖液	50μl
Control DNA	20μl
說明書	1份

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交換反應(yīng)
1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交換反應(yīng)緩沖液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

注：5 pmoles的5′末端約等于0.17μg的長100bp的雙鏈DNA。
3. 37℃反應(yīng)30分鐘。
4. 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀時(shí)使其終濃度達(dá)300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當(dāng) Buffer 溶解沉淀。
注：通過第5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應(yīng)的[γ-32P] ATP，如要完全將其除去時(shí)，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白質(zhì)時(shí)，請?jiān)诘? 步之后進(jìn)行。

二、磷酸化反應(yīng)標(biāo)記

A. 去磷酸化反應(yīng)
1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯fǎng、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小腸堿性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
滅菌的超純水	補(bǔ)足到150μL

3. 50℃反應(yīng)30分鐘。
4. 加入150μl的TE 飽和酚/氯fǎng/異戊醇(25：24：1)，充分混勻。
5.離心，取上層(水層)移到另一個(gè)微量離心管中。
6. 重復(fù)操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì終濃度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反應(yīng)(前反應(yīng))
1.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3.下面的操作與交換反應(yīng)的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記
1.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3.下面的操作與交換反應(yīng)的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記
當(dāng)摻入水平很低的時(shí)候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應(yīng)的標(biāo)記。Sephadex G-50 層析柱(需另購)對于去除未摻入的dNTPs效果很好，它還能大幅減少小于20個(gè)堿基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的雙鏈DNA的量。使用之前需要在70℃加熱5～10分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于10個(gè)堿基的寡核苷酸。

注意事項(xiàng)：
1.緩沖液可在室溫融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應(yīng)緩沖液于-20℃凍結(jié)保存時(shí)會(huì)有白色渾濁出現(xiàn)，但不影響反應(yīng)效果。
3.酶切得到的DNA片段需經(jīng)乙醇沉淀等方法純化。
4. 當(dāng)用于交換反應(yīng)的DNA在5 pmoles以上(約1,000bp以上)時(shí)，標(biāo)記效率有時(shí)會(huì)低于106 cpm/pmol。
5. 如果交換反應(yīng)所用 DNA低于500bp時(shí)，標(biāo)記效率有時(shí)會(huì)有所降低。
6. 若不進(jìn)行放射線標(biāo)記，僅使用本試劑盒做5′末端磷酸化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應(yīng)時(shí)的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用舉例：
按照使用方法中交換反應(yīng)和合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通過正向磷酸化反應(yīng)或交換反應(yīng)標(biāo)記。各DNA片段的放射自顯影結(jié)果如下所示：


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貨號	名稱	規(guī)格
BTN100920	生物素標(biāo)記dUTP溶液(Biotin-11-dUTP)	50μL
BTN70904B	酵母tRNA溶液(精提)	1.5mL
KFS156	細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記染料,長效示蹤C(jī)DCFDA,SE	10mg
KFS167	Ca2+ GPCR分析-鈣離子指示探針 Fluo-3, AM	200μL
KFS313	一氧化氮檢測試劑盒(熒光探針法)	100T
SY0567	iFluor 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(綠色)	300T

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名稱：5′末端同位素標(biāo)記試劑盒
貨號：BTN131036
規(guī)格：20次
本產(chǎn)品為DNA 5′末端標(biāo)記系統(tǒng)，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。原理如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5′末端的磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸化處理，因?yàn)槭褂玫膋inase 能使5′末端的磷酸與[γ-32P]ATP的γ-磷酸進(jìn)行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的5′末端游離的OH基團(tuán)都能通過Kinase反應(yīng)被標(biāo)記(或者只是簡單的磷酸化)。
3. 提供的兩種反應(yīng)液使交換反應(yīng)和磷酸化反應(yīng)都能進(jìn)行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

試劑盒組份：

成分	規(guī)格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交換反應(yīng)緩沖液	100μl
10×磷酸緩沖液	50μl
Control DNA	20μl
說明書	1份

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交換反應(yīng)
1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交換反應(yīng)緩沖液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

注：5 pmoles的5′末端約等于0.17μg的長100bp的雙鏈DNA。
3. 37℃反應(yīng)30分鐘。
4. 70℃加熱5～10分鐘使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀時(shí)使其終濃度達(dá)300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用適當(dāng) Buffer 溶解沉淀。
注：通過第5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應(yīng)的[γ-32P] ATP，如要完全將其除去時(shí)，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白質(zhì)時(shí)，請?jiān)诘? 步之后進(jìn)行。

二、磷酸化反應(yīng)標(biāo)記

A. 去磷酸化反應(yīng)
1. 實(shí)驗(yàn)前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯fǎng、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小腸堿性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
滅菌的超純水	補(bǔ)足到150μL

3. 50℃反應(yīng)30分鐘。
4. 加入150μl的TE 飽和酚/氯fǎng/異戊醇(25：24：1)，充分混勻。
5.離心，取上層(水層)移到另一個(gè)微量離心管中。
6. 重復(fù)操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì終濃度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷無水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。
9.離心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反應(yīng)(前反應(yīng))
1.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
自備的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3.下面的操作與交換反應(yīng)的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記
1.在微量離心管中制備下列反應(yīng)液：

成分	加入的體積
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸緩沖液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
滅菌的超純水	補(bǔ)足到25μL

2. 37℃反應(yīng)30分鐘。
3.下面的操作與交換反應(yīng)的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記
當(dāng)摻入水平很低的時(shí)候，需要使用本步驟，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應(yīng)的標(biāo)記。Sephadex G-50 層析柱(需另購)對于去除未摻入的dNTPs效果很好，它還能大幅減少小于20個(gè)堿基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的雙鏈DNA的量。使用之前需要在70℃加熱5～10分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于10個(gè)堿基的寡核苷酸。

注意事項(xiàng)：
1.緩沖液可在室溫融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應(yīng)緩沖液于-20℃凍結(jié)保存時(shí)會(huì)有白色渾濁出現(xiàn)，但不影響反應(yīng)效果。
3.酶切得到的DNA片段需經(jīng)乙醇沉淀等方法純化。
4. 當(dāng)用于交換反應(yīng)的DNA在5 pmoles以上(約1,000bp以上)時(shí)，標(biāo)記效率有時(shí)會(huì)低于106 cpm/pmol。
5. 如果交換反應(yīng)所用 DNA低于500bp時(shí)，標(biāo)記效率有時(shí)會(huì)有所降低。
6. 若不進(jìn)行放射線標(biāo)記，僅使用本試劑盒做5′末端磷酸化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應(yīng)時(shí)的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用舉例：
按照使用方法中交換反應(yīng)和合成DNA 寡核苷酸的標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通過正向磷酸化反應(yīng)或交換反應(yīng)標(biāo)記。各DNA片段的放射自顯影結(jié)果如下所示：


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