一步法無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科研試驗，我公司專注于DNA提取純化產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的一步法無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括一步法無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：一步法無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒
英文名稱：One-step Endotoxin-free plasmid DNA extraction kit
產(chǎn)品貨號：BTN80201
產(chǎn)品規(guī)格：50次

本試劑盒是在一步式質(zhì)粒DNA提取試劑盒2.0(BTN70903)和液相內(nèi)毒素清除劑(BTN60607)兩產(chǎn)品的基礎(chǔ)上開發(fā)出來的無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑。用本產(chǎn)品提取的質(zhì)粒DNA，內(nèi)毒素的污染濃度低，適合于轉(zhuǎn)染等對內(nèi)毒素的污染敏感的實驗。

試劑盒特點：
1.在提取質(zhì)粒前去除內(nèi)毒素(存在于細(xì)菌表面)，從源頭上避免料內(nèi)毒素和質(zhì)粒DNA 接觸，從根本上防止了內(nèi)毒素對質(zhì)粒DNA的污染。
2. 的一步法質(zhì)粒DNA提取技術(shù)，操作快捷，只需要5-10分鐘。
3.質(zhì)粒回收率高，一次處理后90%的質(zhì)粒DNA可以回收回來。
4. 得到的質(zhì)粒DNA可以直接用于轉(zhuǎn)染等實驗。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
菌體內(nèi)毒素清除劑	200ml
溶液A	50ml
吸附柱活化液	25ml
離心吸附柱(小提)	50只
離心吸附柱(小提)套管	50只
通用預(yù)洗液	50ml
通用洗柱液	50ml
DNA洗脫液2.0	10ml
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸及保存(溶液Azuì好4℃保存)，有效期一年。

使用方法：

一:菌體內(nèi)毒素的清除
1. 收集1.5-3mL E.coli 飽和菌液，12000rpm離心1分鐘，棄上清，得到細(xì)菌沉淀。
2.在沉淀中加入1mL菌體內(nèi)毒素清除劑，溫和混勻后10000-12000rpm離心1分鐘，棄上清(含內(nèi)毒素)。
3. 再重復(fù)上述操作3次，得到的菌體沉淀可以直接進(jìn)入下面的一步法質(zhì)粒DNA提取操作。

二：一步法質(zhì)粒DNA提取
4.在菌體沉淀中加入0.6mL溶液A(用前需搖勻)，充分吹打或振蕩30秒裂解細(xì)菌，直到裂解液變澄清(一般需要半分鐘左右)。注:此方法丌同于堿裂解法，故可以充分吹打或振蕩。
5.活化離心吸附柱：在離心吸附柱中加入0.5mL 吸附柱活化液，套上收集管后室溫放置2分鐘，然后12000rpm離心2分鐘，倒棄穿透液，再將吸附柱套上收集管后待用?；罨蟮碾x心吸附柱必須立即使用。如果丌活化，質(zhì)粒得率將低20-40%左右。
6. 將第4 步得到的裂解液全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫靜置2分鐘使質(zhì)粒DNA 不膜結(jié)合。注意：必須靜止2分鐘，否則質(zhì)粒DNA 丌容易吸附上。
7.室溫12000～15000g離心半分鐘，棄穿透液。
8.在離心吸附柱中加入0.6mL的通用預(yù)洗液(注意:是通用預(yù)洗液，丌是通用洗柱液，丌要用錯。通用預(yù)洗液非常容易產(chǎn)生沉淀，用前需要加熱到60℃左右使之融化，混勻后再用)，室溫12000～15000g離心半分鐘，棄穿透液。
9.在離心吸附柱中加入0.6mL的通用洗柱液，室溫12000～15000g離心半分鐘，棄穿透液。
10.在離心吸附柱中加入0.4mL的通用洗柱液，室溫12000～15000g離心半分鐘，棄穿透液。
11.室溫12000～15000g離心半分鐘，甩干殘留液體。
12. 將離心柱置于一個新的1.5mL自備塑料離心管中，加入30-100μL DNA洗脫液2.0，室溫放置2分鐘。
13. 12000～15000g離心半分鐘，離心管底溶液即無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA。

根據(jù)您的關(guān)注的一步法無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：



名稱：絲狀真菌線粒體DNA提取試劑盒
貨號：BTN130831
規(guī)格：15次
線粒體是重要的、負(fù)責(zé)能量產(chǎn)生的其重要的細(xì)胞器。對絲狀真菌線粒體進(jìn)行生化，遺傳和分子生物學(xué)研究都需要行線粒體純化。本產(chǎn)品就是基于密度梯度離心的，專門用于從絲狀真菌葉片中純化完整線粒體、再從中純化線粒體DNA的試劑盒。

試劑盒特點：
1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。
2. 所得線粒體可用于后續(xù)的SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析、線粒體DNA和線粒體RNA純化。
3. 本產(chǎn)品足夠15次線粒體純化和15次線粒體DNA提取，每次可處理10-20g菌絲體，能得到1-5mg左右線粒體。
4. 已經(jīng)成功用于Aspergillus candidus、Aspergillus nidμLans、Magnaporthe oryzae、Neurospora crassa、Penicillium chrysogenum、Rhizopus stononifer等絲狀真菌。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
溶液A	250mL×2
成分B	150g
溶液C	120ml
帶柄尼龍濾膜	1個
通用線粒體DNA溶液A	10ml
通用線粒體DNA溶液B	5ml
通用線粒體DNA溶液C	15ml
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：純化DNA提取用的線粒體的要求比純化功能研究用的線粒體的要求要低，但整個操作還是zuì好在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液zuì好在4℃預(yù)冷，離心zuì好要在4℃進(jìn)行，離心力以g而不是rpm計算。

一：菌絲的搖瓶培養(yǎng)
1. 使用合適的絲狀真菌培養(yǎng)基，接種孢子至終濃度為2×10E6/mL。一般100mL液體培養(yǎng)基可以得到0.8-1.2g菌絲體，而本方法一次可以處理10-20g菌絲體，故zuì好一次培養(yǎng)1-2升。
2.在合適的溫度(如25℃、30℃或37℃，根據(jù)真菌不同而不同)250rpm/min搖晃培養(yǎng)16-20小時。
3. 用多層紗布或多層過濾紙過濾收集菌絲，用冰浴的自備去離子水洗滌菌絲三次去除殘留的培養(yǎng)基。
4. 用吸水紙吸干菌絲的水分，稱重后立即使用。如果在-80℃或液氮長期放置，線粒體回收效率將減低。

二：線粒體粗提液的制備
5. 制備溶液A工作液：每次提取需150mL溶液A工作液，制備方法是將20mL溶液A和130mL自備去離子水混合，冰上預(yù)冷即可。
6.在200mL燒杯中，加入100mL預(yù)冷的溶液A工作液，再加入新制備的菌絲體，然后全部轉(zhuǎn)移到Waring勻漿機(jī)(家用果汁勻漿機(jī))中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把菌絲按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿10秒。注意：還可以選擇Dounce玻璃勻漿器，Polytron勻漿機(jī)和研磨(加玻璃珠)等方法，但它們單次處理量一般都較小，需多份處理再匯集。
7. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，用預(yù)冷的200mL量筒收集穿透液。
8. 將剩下的菌絲體轉(zhuǎn)移到Waring勻漿機(jī)中，再加入40mL預(yù)冷的溶液A工作液，低速勻漿10秒，用上步的帶柄尼龍濾膜過濾，用預(yù)冷的200mL量筒收集穿透液。注意：帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。
9. 將穿透液分到4個預(yù)冷的50mL的塑料離心管中(每個約35mL)。
10.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 4000g離心10分鐘，小心轉(zhuǎn)移上清(含線粒體的部分)到4個新的離心管中。沉淀含細(xì)胞核和未裂解的細(xì)胞，可以棄之不用。如果要用于純化細(xì)胞核DNA，則可以放-80℃長期保留。
11. 將含上清液的4個離心管在4℃ 10000g離心20分鐘。
12. 每個離心管中加2.5mL預(yù)冷的溶液A工作液重懸線粒體沉淀并匯集(共約10mL)，此為線粒體粗提液。
13. 如果直接用線粒體粗提液提取線粒體DNA，容易有細(xì)胞核DNA污染。
 具體步驟是：在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 10000g離心7分鐘，小心棄上清，沉淀為線粒體，直接用于第三步的線粒體DNA提取。
14. 如果需要高純度、無污染的線粒體DNA，則需要用密度梯度離心法將完整的線粒體和其他細(xì)胞碎片進(jìn)一步分離。具體見下步線粒體精提液的制備。

三：線粒體精提液的制備(密度梯度離心法)
15. 制備重液和輕液：將4.1克成分B干粉加到6.3mL溶液C中，充分搖晃混勻得10mL重液。將4.1克成分B干粉加到6.3mL去離子水中，充分搖晃混勻得10mL輕液。
16.在50mL塑料離心管中先加入10mL重液，再在其上輕輕加上10mL輕液，zuì后加上第11步所得的約10mL線粒體粗提液。
17. 加平衡離心管后在水平轉(zhuǎn)子冷凍超速離心機(jī)上4℃ 43000g離心2小時，重液和輕液間的帶為完整線粒體。
18. 用廣口吸管小心將線粒體轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等倍體積的預(yù)冷的溶液C，輕柔混勻。取少量在相差顯微鏡下檢查線粒體完整性。
19.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 19000 g離心20分鐘，小心將上清吸出后，線粒體沉淀可以直接用于DNA提取。

四：線粒體DNA提取
20. 將600μL通用線粒體DNA提取試劑盒溶液A加入到上步得到的線粒體沉淀中并吹打混勻，然后轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中。
21. 65℃放置5分鐘。
22. 加入300μL通用線粒體DNA提取試劑盒溶液B，震蕩混勻10-30秒。
 注意：溶液B非常粘稠，可以將其預(yù)熱到65℃并剪掉一截槍頭后再取。
23. 加入200μL自備的氯fǎng，震蕩混勻10-30秒。
24. 12000g室溫離心3分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。
25.小心轉(zhuǎn)移上清液(約0.8mL)到一個新的1.5mL離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。
26. 加入1倍體積的通用線粒體DNA提取試劑盒溶液C，顛倒30次混勻。
27. 12000g室溫離心5分鐘，小心棄上清液。
28.在離心管中加入1mL自備的75%乙醇，震蕩30秒。
29. 12000g室溫離心1分鐘，小心棄上清液。
30. 12000g室溫離心半分鐘，殘留液體將匯集在管底。
31. 用洗液槍吸棄管底殘留液(約50μL)。
32. 加50-100μL自備的TE緩沖液，溶解DNA沉淀即得線粒體DNA溶液。直接取5-10μL電泳檢測，其余放直接使用或放-80℃冰箱備用。

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