質(zhì)粒少量提取試劑盒由專業(yè)試劑供應商北京百奧萊博提供，用于科研目的，我公司的質(zhì)粒少量提取試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括質(zhì)粒少量提取試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：質(zhì)粒少量提取試劑盒
英文名稱：Plasmid mini Extraction Kit
產(chǎn)品貨號：WH0036
產(chǎn)品規(guī)格：50次

本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司特有材料，、專一吸附DNA，可zuì大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。以下操作步驟適用于提取5-15ml過夜培養(yǎng)的大腸桿菌，質(zhì)粒提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類和培養(yǎng)條件，細胞的裂解，質(zhì)?？截悢?shù)，質(zhì)粒的穩(wěn)定性，抗生素等因素有關(guān)。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化、文庫篩選、體外翻譯、轉(zhuǎn)染一些常規(guī)的傳代細胞等。

產(chǎn)品特點：
·快速：步驟少，操作簡單，節(jié)省時間。
·：可提取菌體85%以上質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒得率：

質(zhì)粒類型	處理量	得率	質(zhì)粒
高拷貝質(zhì)粒	5-15ml	15-70μg	pTZ,pUC,pBS,pTG-T
低拷貝質(zhì)粒	5-15ml	5-25μg	pBR322,pACYC及其衍生載體pSC101 及其衍生載體，SuperCos,pWE15

試劑盒組成：

組分	50T
平衡液BL	30ml
溶液P1	30ml
溶液P2	30ml
溶液P3	40ml
去蛋白液PD	30ml
漂洗液PW	15ml
洗脫緩沖液EB	15ml
RNaseA（10mg/ml)	300μl
吸附柱CP4	50個
收集管（2ml)	50個

保存條件：室溫（15-25℃)干燥條件下，可保存12個月，更長時間的保存可置于
2-8℃。2-8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，使用前應將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫放置一段時間，必要時可在37℃水浴中預熱10min，以溶解沉淀。次使用前將RNase A加入溶液P1中，混勻后置于2-8℃保存，可穩(wěn)定保存12個月以上。單獨包裝的RNase A在室溫可穩(wěn)定保存12個月以上。

注意事項：（請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項)
1．溶液P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2-8℃保存。
2．使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P3是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。
3．注意不要直接接觸溶液P2和P3，使用后應立即蓋緊蓋子。
4．所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心，速度為12000rpm （~13400×g )。
5．提取的質(zhì)粒量與細菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10 kb的大質(zhì)粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液應在65-70℃預熱。可以適當?shù)难娱L吸附和洗脫的時間，以增加提取效率。
6．實驗前使用平衡液處理吸附柱，可以zuì大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率。
7．用平衡液處理過的柱子zuì好當天使用，放置時間過長會影響效果。
8．去蛋白液PD可以有效去除殘留的蛋白雜質(zhì)，當宿主菌為endA+（TG1、BL21、HB101、ET1256、JM101等）核酸酶含量較高的菌株時，強烈推薦使用去蛋白液PD。

使用方法：
使用前請先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。

1．柱平衡步驟：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm（~13400×g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當天處理過的柱子）
2．取5-15ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12000rpm （~13400×g )離心1 min，盡量吸除上清。
  注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會降低質(zhì)粒的提取效率。
3．向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。
  注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。
4．向離心管中加入500μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。
  注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA。此時菌液應變得清亮粘稠，所用時間不應超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。
5．向離心管中加入700 μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm （~13400×g )離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。
  注意：P3加入后應立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
6．將上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中，其容量為750-800 μl )，注意盡量不要吸出沉淀。12000rpm （~13400×g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。
7．可選步驟：向吸附柱CP4中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm （~13400×g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是endA宿主菌（DH5α，0等），這步可省略。
8．向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（~13400×g )離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。
9．重復操作步驟8。
10．吸附柱CP4放入收集管中，12000rpm（~13400×g )離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。
  注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP4開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11．將吸附柱CP4置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300 μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2-5 min，12000rpm（~13400×g )離心2 min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
  注意：洗脫緩沖液體積不應少于100 μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，再次離心。

質(zhì)粒DNA濃度及純度檢測：
1．得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。電泳可能為單一條帶，也可能為2到3條DNA條帶，這主要與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關(guān)。OD₂₆₀值為1相當于大約50 μg/ml雙鏈DNA。
2．OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用ddH2O，比值會偏低，但并不表示純度低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值。

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