線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于生化實(shí)驗(yàn)研究等領(lǐng)域，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價(jià)位合理，需要線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒等探針標(biāo)記及檢測(cè)產(chǎn)品的客戶，請(qǐng)到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒(流式分析)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒(流式分析)
英文名稱：Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry)
產(chǎn)品貨號(hào)：SY0583
產(chǎn)品規(guī)格：100T

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，又稱線粒體巨型通道（magachannel），是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的非選擇性高導(dǎo)電性通道，由多種蛋白質(zhì)復(fù)合組成。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mPTP)可能參與了細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放。

正常的細(xì)胞線粒體內(nèi)膜可維持正常的線粒體電位梯度以保證細(xì)胞呼吸作用及能量供應(yīng)，隨著Ca2+的攝入和釋放，一種低電導(dǎo)滲透性轉(zhuǎn)換孔在張開和閉合中來回切換。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)和病理性死亡時(shí)，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca2+的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細(xì)胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會(huì)導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔檢測(cè)試劑盒（流式分析）檢測(cè)方法是一種相對(duì)于僅基于線粒體膜電位分析更直接的檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放的檢測(cè)方法。其原理是：先通過被動(dòng)運(yùn)輸加載Calcein AM，后者是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，能夠輕易穿透活細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的性分子 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，使胞質(zhì)包括線粒體發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。加入CoCl2后，來自胞質(zhì)的熒光被CoCl2淬滅，僅留下線粒體內(nèi)的熒光。作為對(duì)照，可將細(xì)胞加載Calcein AM和CoCl2的同時(shí)，對(duì)其用離子霉素處理，從而使細(xì)胞加載更多的Ca2+，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的激活從而使線粒體熒光淬滅。

本試劑盒以1ml標(biāo)記體系計(jì)算，可供100次檢測(cè)。檢測(cè)zuì大激發(fā)波長494nm，zuì大發(fā)射波長517nm。

產(chǎn)品組份：
Calcein AM———————5×50μg
DMSO——————————250μl
CoCl2(80mM)——————1.2ml
Ionomycin(100μM)————750μl
Cell Stain Buffer———2×250ml

儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥，避免反復(fù)凍融，有效期至少6個(gè)月

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名稱：PCR法DNA探針生物素標(biāo)記試劑盒
貨號(hào)：BTN90604B
規(guī)格：5次
PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zuì后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規(guī)PCR(用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì)照反應(yīng))和5次50μl體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3.一次標(biāo)記可以得到μg級(jí)的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標(biāo)記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個(gè)核苷酸中有4-5個(gè)將帶有非同位素標(biāo)記)，有效降低了空間阻礙，檢測(cè)效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×標(biāo)記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標(biāo)記專用PCR Mix不含dNTP。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì)PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2. 根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3. 由于標(biāo)記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進(jìn)行PCR標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來提高成功率，即先制備非標(biāo)記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記PCR產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置50μL PCR的反應(yīng)體系：

成份	用量
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水	補(bǔ)到50μL

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。
6.電泳檢測(cè)和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產(chǎn)物(具體取決于PCR產(chǎn)物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記PCR。
三：標(biāo)記PCR反應(yīng)(zuì好做一個(gè)不加標(biāo)記的對(duì)照用于定量)
說明：在設(shè)置下面反應(yīng)時(shí)，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性，這種復(fù)性會(huì)與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競爭，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的DNA探針。

成份	樣品	對(duì)照
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標(biāo)記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二 單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物 (單鏈標(biāo)記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補(bǔ)到50μL	補(bǔ)到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過優(yōu)化，如果自備標(biāo)記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對(duì)DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對(duì)BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對(duì)擴(kuò)增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好)，所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時(shí)間增加15秒，因?yàn)闃?biāo)記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對(duì)照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。
 注意：如果擴(kuò)增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠(yuǎn)低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對(duì)之間的，而單鏈DNA沒有堿基對(duì)，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少)，因此EB染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過單鏈PCR擴(kuò)增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入(對(duì)單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對(duì)雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時(shí)不用請(qǐng)放-20℃長期保存。如果需要純化，請(qǐng)使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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